Aplicações da reação em cadeia da polimerase (PCR)

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma potente técnica central da biologia molecular que é um método in vitro eficaz e rápido para amplificação enzimática de sequências específicas de DNA ou RNA de várias fontes. A PCR padrão consiste no DNA-alvo, um conjunto de primers de oligonucleotídeos sintéticos que se posicionam ao lado da sequência do DNA-alvo, uma DNA polimerase termoestável (geralmente Taq polimerase) e nucleotídeos. Com o uso de termocicladores, há três fases durante cada ciclo de amplificação, incluindo a desnaturação do DNA dupla-fita (dsDNA) em DNA de fitas simples separadas, hibridização de primers à sequência do DNA-alvo e amplificação, em que a DNA polimerase amplia o DNA a partir dos primers, criando um novo dsDNA com uma fita antiga e uma nova. As fitas sintetizadas em um ciclo servem de molde para o próximo, resultando em um aumento de milhões de vezes na quantidade de DNA em apenas 20 ciclos.

PCR por Transcriptase reversa (RT- PCR)

RT-PCR ou PCR com transcriptase reversa é uma variação da técnica de PCR padrão que envolve a amplificação de mRNA específico obtido de amostras muito pequenas. Ela elimina a necessidade do entediante processo de purificação de mRNA necessário para as técnicas de clonagem convencionais. Com RT-PCR, usa-se transcriptase reversa e uma amostra de RNA, além dos reagentes de PCR padrão. A mistura de reação é aquecida a 37 °C, o que permite a produção de cópias complementares de cDNA a partir da amostra de RNA pela transcriptase reversa. Em seguida, esse cDNA é hibridizado a um dos primers, levando à síntese da primeira fita. A partir desse ponto, segue-se a PCR padrão, em que o dsDNA é, por fim, gerado. Frequentemente a RT-PCR é combinada com PCR em tempo real (qPCR), que é amplamente usada para a quantificação de níveis de transcritos em células e tecidos.

PCR hot start

PCR hot start é uma tecnologia que inibe a Taq polimerase hot start ou a incorporação de dNTPs modificados durante o preparo da reação até a ocorrência de uma etapa de termoativação. Vários métodos estão disponíveis para interromper a atividade da polimerase hot start e incluem métodos de modificação química, métodos mediados por anticorpos e mediados por aptâmeros.

PCR end-point para amplificação longa e precisa de alvos

A PCR end-point é frequentemente usada para detectar a presença de alvos e a abundância relativa no final da reação. O comprimento restrito de sequências produzidas durante a PCR padrão, aproximadamente 5 kb, é superado em parte com a incorporação de fatores adicionais que oferecem uma atividade de “revisão”. A PCR de alta fidelidade e longo alcance (LA) incorpora o uso de uma segunda polimerase termoestável com exonuclease 3′→5′ para reparar as incorporações errôneas de nucleotídeos terminais, resultando em uma fidelidade significativamente aumentada e a capacidade de amplificar alvos de DNA de até 40 kb.