Wytyczne dotyczące rozpuszczalności peptydów

Niewłaściwa solubilizacja może potencjalnie spowodować utratę peptydu/białka i doprowadzić do niepowodzenia eksperymentu. Jeśli informacje na temat rozpuszczalności są dostępne, można je znaleźć na stronie informacyjnej produktu lub w certyfikacie analizy. Jeśli informacje o rozpuszczalności nie są znane, istnieją co najmniej trzy podstawowe wymagania dotyczące wyboru rozpuszczalnika do rozpuszczenia peptydu lub białka przed użyciem.

1. Wybierz rozpuszczalnik, który skutecznie rozpuszcza białko.
2. Rozpuszczalnik musi być kompatybilny z aplikacją eksperymentalną.
3. Rozpuszczalnik nie powinien reagować z białkiem ani sprzyjać jego degradacji.

Dodatkowo, zawsze dobrym pomysłem jest przetestowanie rozpuszczalności niewielkiej części próbki przed rozpuszczeniem całej próbki i wybranie początkowego rozpuszczalnika, który można łatwo usunąć przez liofilizację. Umożliwia to odzyskanie peptydu/białka z rozpuszczalnika.

Określenie charakterystyki rozpuszczalności

Przed dodaniem jakiegokolwiek rozpuszczalnika do liofilizowanego peptydu, ważne jest, aby ocenić skład aminokwasowy peptydu jako wstępne narzędzie do zrozumienia charakterystyki rozpuszczalności peptydu. Liczba i rodzaje ładunków jonowych w peptydzie określają jego rozpuszczalność w roztworach wodnych. Ogólnie rzecz biorąc, im więcej naładowanych reszt posiada peptyd, tym lepiej jest rozpuszczalny w roztworach wodnych. Ponadto, peptydy generalnie mają więcej ładunków przy pH 6-8 niż przy pH 2-6. Z tego powodu peptydy lepiej rozpuszczają się przy pH zbliżonym do obojętnego. Wśród wielu wyjątków od tej reguły są sekwencje peptydowe, które są bardzo hydrofobowe i te, które mają tendencję do agregacji. Podczas gdy hydrofobowość sekwencji jest główną przyczyną agregacji, peptydy mogą również agregować lub "żelować" poprzez rozległą sieć wiązań wodorowych. Poniższe wytyczne służą do określenia, czy peptyd jest zasadowy, kwaśny czy obojętny.

1. Przypisać wartość -1 do każdej reszty kwaśnej (D, E i C-końcowy COOH).
2. Przypisać wartość +1 do każdej reszty zasadowej (K, R i N-końcowy NH₂).
3. Przypisać wartość +1 do każdej reszty H przy pH <6 i zero przy pH >6.
4. Zlicz całkowitą liczbę ładunków peptydu przy pH 7 (wszystkie D, E, K, R, C-końcowe COOH i C-końcowe NH₂).
5. Oblicz całkowity ładunek netto peptydu.

Podejście do rozpuszczania naładowanych peptydów

W oparciu o powyższe wytyczne, przystąp do testowania rozpuszczalności peptydu przy użyciu następujących strategii:

1. Jeśli ogólny ładunek netto peptydu jest ujemny, peptyd jest uważany za kwaśny. Jeśli peptyd jest kwaśny i/lub jeśli całkowita liczba ładunków peptydu przy pH 7 jest większa niż 25% całkowitej liczby reszt, dodaj niewielką ilość 0,1M wodorowęglanu amonu, aby rozpuścić peptyd i rozcieńczyć go wodą do pożądanego stężenia. Upewnij się, że wynikowe pH roztworu peptydu wynosi około 7 i dostosuj pH w razie potrzeby.
2. Jeśli ogólny ładunek netto peptydu jest dodatni, peptyd jest uważany za zasadowy. Jeśli peptyd jest zasadowy, a całkowita liczba ładunków peptydu przy pH 7 wynosi między 10-25% całkowitej liczby reszt, dodaj niewielką ilość 25% kwasu octowego, aby rozpuścić peptyd i rozcieńczyć go wodą do pożądanego stężenia.
3. Jeśli całkowity ładunek netto peptydu wynosi zero, peptyd jest uważany za neutralny. Jeśli całkowita liczba ładunków jest większa niż 25% całkowitej liczby reszt, należy zastosować strategię opisaną w sekcji 1. Jeśli całkowita liczba ładunków wynosi między 10-25% całkowitej liczby reszt, należy użyć rozpuszczalników organicznych (patrz poniżej).
4. Jeśli całkowita liczba ładunków peptydu jest mniejsza niż 10% całkowitej liczby reszt, zaleca się stosowanie rozpuszczalników organicznych.

Uwaga: ważne jest, aby całkowicie rozpuścić peptyd w początkowym rozpuszczalniku (takim jak kwas octowy, acetonitryl, DMSO lub DMF), ponieważ szybkość rozpuszczania peptydów w tych rozpuszczalnikach jest zwykle wyższa niż w mieszaninie woda/rozpuszczalnik. Jeśli mieszanina woda/rozpuszczalnik zostanie użyta jako pierwsza do rozpuszczenia peptydu, może się zdarzyć, że do próbki peptydu zostanie dodana znacznie większa niż konieczna ilość niewodnego rozpuszczalnika.

Dla każdego użytego rozpuszczalnika maksymalne stężenie początkowego rozpuszczalnika będzie zależeć od tolerancji testu na ten konkretny rozpuszczalnik. Przed wypróbowaniem silniejszych rozpuszczalników konieczne jest sonikowanie roztworu peptydu w celu potwierdzenia, że peptyd jest nierozpuszczalny w rozpuszczalniku. Sonikacja zwiększa rozpuszczalność, rozbijając stały peptyd na mniejsze cząstki. Jeśli po sonikacji roztwór zżelował, wydaje się mętny lub ma widoczne cząstki stałe, peptyd nie rozpuścił się całkowicie, ale jest zawieszony. W tym momencie konieczne jest użycie silniejszego rozpuszczalnika. Jeśli peptyd nie rozpuszcza się, należy liofilizować i usunąć lotny roztwór buforowy. Po wyschnięciu próbki można wypróbować alternatywne rozpuszczalniki na tej samej próbce.

Po rozpuszczeniu peptydu w początkowym rozpuszczalniku, zwłaszcza rozpuszczonym w rozpuszczalnikach organicznych, rozcieńczyć peptyd przez powolne dodawanie (kroplami) roztworu peptydu do buforowanego roztworu z delikatnym, ale stałym mieszaniem. Ma to na celu zapobieganie miejscowemu stężeniu peptydu w roztworze wodnym, co może potencjalnie prowadzić do wytrącenia peptydu. Dodatkową zaletą tej strategii jest to, że możliwość wytrącenia można monitorować wizualnie i odpowiednio postępować.

Podejście do rozpuszczania hydrofobowych/nienaładowanych peptydów

Powyższe zalecenia oparte na naładowanej naturze peptydu będą prawdopodobnie nieodpowiednie do rozpuszczania peptydów zawierających ponad 50% hydrofobowych reszt w ich sekwencji, neutralnych peptydów z mniej niż 25% ładunków i / lub peptydów, które mają mniej niż 10% ładunków. W takich warunkach zaleca się stosowanie rozpuszczalników organicznych, takich jak acetonitryl (ACN), dimetylosulfotlenek (DMSO) lub dimetyloformamid (DMF).

Uwaga: sekwencje peptydów zawierające Cys (C) i Met (M) są niestabilne w DMSO.

Dodanie związków chaotropowych, takich jak chlorowodorek guanidyny lub mocznik, może ułatwić rozerwanie oddziaływań hydrofobowych lub zmniejszyć "żelowanie" peptydów poprzez przerwanie sieci wiązań wodorowych. Ponownie, stężenie początkowego rozpuszczalnika organicznego lub odczynników chaotropowych będzie zależeć od tolerancji systemu testowego.