Testowanie zanieczyszczeń nitrozoaminowych metodami LC-MS z rozdziału ogólnego Farmakopei Stanów Zjednoczonych <1469>

Tim Mueller, Site Management-Analytical, Patrik Appelblad, Senior Principal Scientist

Merck

Article from Analytix Reporter - Issue 14

Wprowadzenie

Nitrozoaminy są niepożądanymi produktami ubocznymi obecnymi w wielu substancjach i podejrzewa się, że mają właściwości toksyczne i rakotwórcze. W surowcach farmaceutycznych i gotowych produktach leczniczych nitrozoaminy mogą również powstawać jako produkty uboczne syntezy, podczas przechowywania lub pakowania itp. Zapotrzebowanie na analizę nitrozoamin gwałtownie wzrosło na całym świecie. Lista zanieczyszczeń nitrozoaminowych wytwarzanych z substancji leczniczych przy użyciu określonych szlaków syntetycznych wzrosła po szeroko zakrojonych ocenach szlaków syntetycznych.

Rysunek 1. Struktura chemiczna N-nitrozodimetyloaminy (NDMA).

Farmakopea Stanów Zjednoczonych (USP) opublikowała w grudniu 2021 r. nowe procedury w odpowiedzi na nieoczekiwane wykrycie nitrozoamin, takich jak zanieczyszczenie N-nitrozodimetyloaminą (NDMA), Rysunek 1, w niektórych aktywnych składnikach farmaceutycznych (API) i odpowiadających im preparatach końcowych.¹ Nowy rozdział USP <1469> zawiera zalecenia dotyczące tworzenia kontroli limitów zanieczyszczeń nitrozoaminowych w celu zapewnienia ich eliminacji lub redukcji oraz charakterystyki wydajności metod analitycznych dla procedur testowania nitrozoamin przy użyciu zarówno GC-MS (procedury 2 i 4), jak i LC-MS (procedury 1 i 3).

Niniejszy artykuł koncentruje się na procedurach testowych opartych na LC-MS (procedura 1 i 3) do analizy ilościowej znanych zanieczyszczeń nitrozoaminowych w lekach i surowcach farmaceutycznych przy użyciu chromatografii cieczowej i detekcji spektrometrycznej. Chociaż oceniano obie metody, przedstawione zostaną końcowe warunki przebiegu i dane z procedury 3. Kryteria przydatności systemu dla procedury 1 nie mogły zostać spełnione przy użyciu dostępnego oprzyrządowania, ale zostaną opisane.

Procedura 1 wyznacza użycie spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości (HRMS) i może być stosowana do ilościowego oznaczania NDMA, NDEA (nitrozodietyloamina), NDBA (nitrozodibutyloamina), NDIPA (N-nitrozodiizopropyloamina), NEIPA (N-nitrozoetyloizopropyloamina), NMBA (kwas N-nitrozometyloaminomasłowy) i NMPA (N-nitrozometylofenyloamina) w wybranych sartanach (walsartan, irbesartan i losartan potasowy). Procedura 3 wykorzystuje MS/MS i może być stosowana do ilościowego oznaczania NDMA, NDEA, NDIPA, NEIPA, NMBA i NDBA w wybranych sartanach (walsartan, losartan potasowy, olmesartan medoksomil, kandesartan cyleksetyl i telmisartan).

Warunki eksperymentalne

Przygotowanie próbek i wzorców

Użyte wzorce i roztwory próbek przygotowano w następujący sposób:

•  Roztwór wzorca wewnętrznego: Po 10 μg/ml NDMA-d6 i NMBA-d3 oraz po 1 μg/ml NDEA-d10 i NDBA-d18 przygotowano w wodzie
• Mieszanina podstawowych roztworów wzorcowych nitrozoamin: Mieszaninę zawierającą po 200 ng/ml NDMA, NEIPA, NDIPA, NDBA i NMBA przygotowano przez zmieszanie odpowiednich objętości odpowiednich wzorców referencyjnych USP i rozcieńczono wodą.
• Roztwór podstawowy wzorca NDEA: Roztwór o stężeniu 132 ng/ml NDEA został przygotowany przez rozcieńczenie USP N-Nitrozodietyloaminy RS wodą.
• Roztwory standardowe: W zależności od docelowego stężenia nitrozoaminy w próbce, przygotowano zestaw 5 kolejnych roztworów liniowości, jak opisano w Tabeli 1 z mieszaniny podstawowego roztworu wzorcowego nitrozoaminy i podstawowego roztworu wzorcowego NDEA, mieszając określone objętości każdego roztworu, jak wskazano.
• Próbki przygotowano w następujący sposób:
  1.  80 mg substancji leczniczej przeniesiono do 2 ml probówki wirówkowej z przykrywką.
  2.  Dodanie 1188 μL rozcieńczalnika (1% kwas mrówkowy w wodzie) i 12 μL roztworu wzorca wewnętrznego.
  3.  Worteksowanie przy 2500 obr/min przez 20 min (z wyjątkiem losartanu potasu, który powinien być worteksowany NMT 5 min).
  4.  Wirowanie z prędkością około 10 000 obrotów na minutę przez 10 minut
  5.  Przefiltrowanie do fiolki przy użyciu filtra PTFE o wielkości porów 0,45 µm.

Tabela 1. Przygotowanie roztworów wzorcowych nitrozoaminy (protokół rozcieńczania) dla procedury 3

Rozwiązanie liniowe #	Poziom stężenia	Stężenie NDMA, NMBA, NDBA, NEIPA, NDIPA/NDEA (ng/ml)	Zawartość NDMA, NMBA, NDBA, NEIPA, NDIPA /NDEA (ppb)	Mieszanina standardowych roztworów podstawowych nitrozoaminy (μL)	Standardowy roztwór podstawowy NDEA (μL)	Woda (μL)	Wewnętrzna norma   (μL)	Objętość całkowita   (μL)
1	L1	1.33/0.66	19.95/10	8	6	1174	12	1200
2	L2	2/0.88	30/13.5	12	8	1168	12	1200
3	L3	5/3.3	75/49.5	30	30	1128	12	1200
4	L4	7.5/4.95	112.5/74.25	45	45	1098	12	1200
5	L5	10/6.6	150/99	60	60	1068	12	1200
6	L6	15/9.9	225/148.5	90	90	1008	12	1200
7	L7	30/19.8	450/297	180	180	828	12	1200
8	L8	60/39.6	900/594	360	360	468	12	1200
9	L9	90/59.4	1350/891	540	540	108	12	1200

Próbki walsartanu

Roztwór próbki walsartanu został przygotowany zgodnie z protokołem przygotowania próbki. "Walsartan" w Tabeli 8 oznacza produkt leczniczy (tabletka/tabletka w proszku).

Próbki losartanu

Roztwór próbki losartanu został przygotowany zgodnie z protokołem przygotowania próbki. "Losartan" w Tabeli 10 odpowiada tabletkom losartanu lub mielonym tabletkom losartanu

LC-MS (Procedura 3)

Rozdzielenia przeprowadzono w systemie Agilent 1290 Infinity II HPLC (Agilent, Waldbronn, Niemcy) wyposażonym w detektor 6495C triple quadrupole MS z APCI Source. Separacje chromatograficzne przeprowadzono w trybie gradientowym na kolumnie Ascentis^® Express C18 (USP L1 Packing) 150×3,0 mm I.D., 2,7 µm (patrz Tabela 2-4).

Tabela 2. Warunki eksperymentalne dla procedury 3

Parametry HPLC
Kolumna:	Kolumna Ascentis® Express C18 150×3.0 mm I.D, 2.7 µm (53816-U)
Faza ruchoma:	[A] 0.1% kwas mrówkowy w H2O; [B] 0.1% kwasu mrówkowego w metanolu
Gradient:	Czas (min)	% A	%B
	0.0	97	3
	1.5	97	3
	4.0	50	50
	7.0	25	75
	8.1	15	85
	9.2	5	95
	12.0	5	95
	12.1	97	3
	15.0	97	33
Prędkość przepływu:	0.5 mL/min
Temperatura kolumny:	60 °C
Temperatura autosamplera:	18 °C
Detekcja:	MRM, APCI (+), patrz Tabela 3 & 4
Objętość iniekcji:	20 µL
Próbki	Standardy i roztwory walsartanu/losartanu zgodnie ze wskazaniami

Tabela 3. Parametry instrumentu MS stosowane do celów ilościowych dla procedury 3

Parametry detektora MS
Instrument:	Agilent 6495C Triple quadrupole MS
Źródło:	APCI
Detekcja:	Parametry przyrządu jak pokazano w tej tabeli.
Parametr źródła
Temperatura gazu:	290 °C
Przepływ gazu suszącego:	11 l/min
Ciśnienie nebulizatora:	25 psi
Temperatura parownika:	350 °C
Napięcie kapilarne:	3000 V
Prąd kory:	4 µA
Fragmentator:	166 V
Polaryzacja jonów:	dodatnia

Tabela 4. Przejścia MRM dla zanieczyszczeń nitrozoaminowych - procedura 3

			Przejścia MRM (m/z)
Nitrozamina	Polaryzacja	MRM-1 (Ilościowy)		MRM-2
NDMA	Dodatni	75.0	43.0	75.0	44.1
NDMA-D6	Dodatni	81.2	46.0	81.2	64.1
NDEA	Dodatni	103.1	75.1	103.1	47.1
NDEA-D10	Dodatni	113.2	34.2	113.2	49.1
NMBA	Positive	147.1	44.1	147.1	117.1
NMBA-D3	Dodatni	150.1	47.1	150.1	120.2
NDBA	Dodatni	159.2	41.1	159.2	29.1
NDBA-D18	pozytywny	177.3	66.2	177.3	46.2
NEIPA*	Dodatni	117.1	75.1	117.1	47.2
NDIPA*	pozytywny	131.2	89.1	131.1	47.1

Obsługa danych

Zbieranie i przetwarzanie danych przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Masshunter w wersji 10.0.
 

Wyniki i dyskusja

Ocena procedury 1

.Metoda procedury 1 USP opisuje zastosowanie chromatografii cieczowej i wysokorozdzielczej detekcji spektrometrycznej mas (LC-HRMS), ale podane warunki eksperymentalne¹ nie wydają się wystarczająco ogólne, aby umożliwić wdrożenie i walidację na dowolnej platformie HRMS. Nasze laboratorium doświadczyło problemów z czułością ultranowoczesnego detektora HRMS (Agilent 6546 Q-TOF), a w celu weryfikacji wyników przetestowano różne kolumny HPLC, rozpuszczalniki i odczynniki. Kryteria przydatności systemu chromatograficznego mogły zostać spełnione, ale nie było możliwe spełnienie kryteriów przydatności systemu do ogólnej identyfikacji i czułości.

Porównywalne intensywności sygnałów uzyskano przy 1 µg/ml, 100 ng/ml i 50 ng/ml dla NDEA, NEIPA, NDIPA, NDBA i NMPA (tryb dodatni ESI) przy użyciu kolumny Supelco^® L43 (Ascentis^® Express F5), patrz Rysunek 2 i kolumny L43 dwóch innych producentów (nie pokazano). Zanieczyszczenia NDMA nie wykryto na ŻADNEJ kolumnie na wszystkich poziomach stężenia, a NMBA nie wykryto na żadnej kolumnie w trybie ESI(-). Porównanie różnych kolumn L43 (grupy pentafluorofenylowe chemicznie związane z cząsteczkami krzemionki za pomocą przekładki propylowej) wykazało podobne ogólne zachowanie z procedurą 1 przy użyciu instrumentu LC-HRMS, ale nie było możliwe spełnienie wymagań systemu w zakresie identyfikacji i czułości. Niedawno na forum USP Pharmacopeial Forum (USP-PF) pojawiły się dalsze wyjaśnienia dotyczące procedury 1. Wspomniano w nim, że analizy zostały przeprowadzone i zwalidowane za pomocą spektrometru masowego Orbitrap Fusion Lumos Tribrid. Ponieważ ten typ oprzyrządowania nie był dostępny w naszym laboratorium, dalsza walidacja procedury 1 nie była kontynuowana.

Rysunek 2. Chromatogram mieszaniny nitrozoamin o stężeniu 100 ng/mL analizowany przy użyciu kolumny Supelco^® L43 (Ascentis^® Express F5), tryb ESI(+).

Ocena procedury 3

Ta metoda opisuje zastosowanie chromatografii cieczowej i tandemowej detekcji spektrometrycznej mas (LC-MS/MS) do ilościowego oznaczania NDMA, NDEA, NDIPA, NEIPA, NMBA i NDBA w wybranych sartanach (walsartan, losartan potasowy, olmesartan medoksomil, kandesartan cyleksetyl i telmisartan). W procedurze wymieniono dwa kryteria przydatności systemu: 1. Współczynnik korelacji: NLT 0,99 i 2. y-Intercept: Nie więcej niż (NMT) 25% odpowiedzi roztworu o średnim stężeniu użytego do wygenerowania krzywej wzorcowej. W przyszłości przedstawione zostaną dane analityczne z prac nad ustaleniem zwalidowanej procedury analitycznej 3 przy użyciu kolumny Ascentis^® Express C18 150 x 3,0 mm (opakowanie USP L1) z cząstkami 2,7 μm. Przykład wzorca zanieczyszczenia nitrozoaminą na tej kolumnie pokazano na Rysunku 3.

Rysunek 3. Chromatogram MRM (bez skalowania) roztworu wzorcowego nitrozoaminy o stężeniu 90 ng/ml przy użyciu kolumny Ascentis^® Express C18 dla procedury 3.

Liniowość metody została określona na dziewięciu poziomach kalibracji po zoptymalizowaniu konfiguracji instrumentalnej. Wykonano potrójne wstrzyknięcia każdego roztworu liniowości. Rozdział USP <1469> określił dwa wymagania dotyczące przydatności systemu dla procedury 3. Współczynnik korelacji nie powinien być mniejszy niż (NLT) 0,99, a punkt odcięcia y dla każdego wykresu kalibracyjnego nie powinien być większy niż (NMT) 25% odpowiedzi roztworu o średnim stężeniu użytego do wygenerowania krzywej wzorcowej. Jak pokazano w Tabeli 5, oba te wymagania zostały spełnione.

Tabela 5. Wymagania dotyczące odpowiedniości systemu metody, procedura 3

Analyte	Współczynnik korelacji	y-Intercept (maks. y-Intercept)
NDMA	0.9960	0.001851 (< 0.031125)
NMBA	0.9932	0.000409 (< 0.022675)
NDEA	0.9986	0.000167 (< 0.018575)
NEIPA	0.9952	0.001380 (< 0.0939)
NDIPA	0.9959	0.000144 (< 0.032175)
NDBA	0.9936	0.019615 (< 0.2201)

Precyzję metody (Tabela 6) i dokładność (Tabela 7) określono na podstawie danych z dziesięciu wstrzyknięć poziomów kalibracji 1, 5 i 9 (L1, L5 i L9). Dokładności roztworów poziomów 1, 5 i 9 obliczono przy użyciu 9-punktowych krzywych kalibracji opisanych w Tabeli 1.

Tabela 6. Precyzja metody Procedury 3 określona na podstawie poziomu kalibracji 1, 5 i 9 (n=10 na każdym poziomie)

Analyte	Concentration (ng/mL)	Średnia odpowiedź	Względne odchylenie standardowe (%)
NDMA	1.33	21687	1.7
	10	168086	2.3
	90	1513884	0.7
NMBA	1.33	398	5.6
	10	3093	7.6
	90	27009	2.7
NDEA	0.66	4443	2.5
	6.6	46576	2.4
	59.4	455404	1.1
NEIPA	1.33	18033	1.6
	10	148983	2.9
	90	1395374	0.9
NDIPA	1.33	6470	1.6
	10	54903	3.8
	90	523857	0.8
NDBA	1.33	12255	4.0
	10	92155	6.2
	90	827071	3.3

Tabela 7. Dokładność metody Procedury 3 określona dla poziomów 1, 5 i 9 przy użyciu krzywej kalibracyjnej każdego odpowiedniego analitu (n=10 na każdym poziomie).

Analit	Stężenie (ng/mL)	Średnia dokładność (%)	Średnia dokładność (%) right;">Średnia dokładność (%)	Względne odchylenie standardowe (%)
NDMA	1.33	100.85	0.6
	10	97.90	1.1
	90	100.03	0.5
NMBA	1.33	109.93	7.0
	10	95.65	5.3
	90	98.66	3.7
NDEA	0.66	106.56	2.4
	6.6	96.04	1.0
	59.4	103.51	0.9
NEIPA	1.33	105.93	1.4
	10	97.86	2.4
	90	100.38	1.1
NDIPA	1.33	106.34	1.4
	10	96.80	3.6
	90	100.55	1.0
NDBA	1.33	95.64	2.2
	10	100.86	3.7
	90	98.44	2.2

Metody granicy wykrywalności (LOD) i granicy oznaczalności (LOQ) określono przez dodanie 3,3 ng/ml (2,2 ng/ml dla NDEA) do roztworu próbki walsartanu/ losartanu i zastosowanie stosunku sygnału do szumu (S/N) do obliczeń. Granicę wykrywalności zdefiniowano jako stosunek sygnału do szumu S/N równy 3, natomiast granicę oznaczalności zdefiniowano jako stosunek S/N równy 10. Stosunek S/N został obliczony przez oprogramowanie urządzenia, gdzie stosunek S/N dla każdego piku jest ustalany automatycznie przy użyciu wysokości piku i zdefiniowanego obszaru szumu. Wynikowe wartości graniczne dla mierzonych próbek przedstawiono w Tabeli 8-11.

Tabela 8. Granica wykrywalności (LOD) i granica oznaczalności (LOQ) metody w roztworze próbki walsartanu

NDMA		NBMA		NDEA		NEIPA		NDIPA		NDBA
LOD (ng/L)	LOQ (ng/L)	LOD (ng/L)	LOQ (ng/L)	LOD (ng/L)	LOQ (ng/L)	LOD (ng/L)	LOQ (ng/L)	LOD (ng/L)	LOQ (ng/L)	LOD (ng/L)	LOQ (ng/L)
12	41	103	343	19	63	19	63	7	22	63	211

Tabela 9. Granica wykrywalności metody (LOD) i granica oznaczalności (LOQ) dla zawartości analitu w walsartanie

NDMA		NBMA		NDEA		NEIPA		NDIPA		NDBA
LOD (ng/g)	LOQ (ng/g)	.LOD (ng/g)	LOQ (ng/g)	LOD (ng/g)	LOQ (ng/g)	LOD (ng/g)	LOQ (ng/g)	LOD (ng/g)	LOQ (ng/g)	LOD (ng/g)	LOQ (ng/g)
0.18	0.62	1.55	5.15	0.28	0.94	0.28	0.95	0.10	0.33	0.95	3.16

Tabela 10. Granica wykrywalności metody (LOD) i granica oznaczalności (LOQ) w roztworze próbki losartanu

NDMA		NBMA		NDEA		NEIPA		NDIPA		NDBA
LOD (ng/L)	LOQ (ng/L)	LOD (ng/L)	LOQ (ng/L)	LOD (ng/L)	LOQ (ng/L)	LOD (ng/L)	LOQ (ng/L)	LOD (ng/L)	LOQ (ng/L)	LOD (ng/L)	LOQ (ng/L)
12	41	96	320	25	85	13	43	8	27	474	1580

Tabela 11. Granica wykrywalności metody (LOD) i granica oznaczalności (LOQ) dla zawartości analitu w losartanie potasu

NDMA		NBMA		NDEA		NEIPA		NDIPA		NDBA
LOD (ng/g)	LOQ (ng/g)	.LOD (ng/g)	LOQ (ng/g)	LOD (ng/g)	LOQ (ng/g)	LOD (ng/g)	LOQ (ng/g)	LOD (ng/g)	LOQ (ng/g)	LOD (ng/g)	LOQ (ng/g)
0.18	0.62	1.44	4.80	0.38	1.27	0.19	0.64	0.12	0.41	7.11	23.70

Specyficzność metody została określona poprzez monitorowanie czasu retencji analitów i ich względnej retencji w stosunku do retencji NDBA dla serii wstrzyknięć standardowych roztworów nitrozoaminy (n=40).

Tabela 12. Metoda procedury 3 - specyfika metody

Analit	Średni czas retencji (min)	Względny czas retencji (RRT)	Względny czas retencji (RRT) wg USP 1469
NDMA	2.100	0.27	0.20
NMBA	3.528	0.45	0.31
NDEA	4.681	0.60	0.46
NEIPA	5.345	0.68	0.57
NDIPA	5.951	0.76	0.66
NDBA	7.859	1.00	1.00

Odzysk analitu określono w jednej partii walsartanu i w jednej partii losartanu potasowego (Tabela 13). Partie substancji leczniczej zostały wzbogacone wszystkimi analitami na trzech poziomach stężenia jako triplikaty podczas procedury przygotowania próbki. Przygotowane roztwory próbek zostały zmierzone i ocenione względem zewnętrznej krzywej kalibracyjnej w celu obliczenia indywidualnego stężenia analitu. Stosunek sygnału wzorca wewnętrznego do sygnału analitu określono w roztworze próbki i w roztworach (zewnętrznego) rzędu kalibracji, tj. sygnał NDMA-D₆ / sygnał NDMA. Następnie stosunki sygnałów wykorzystano do obliczenia stężenia w roztworze próbki w stosunku do roztworów kalibracyjnych.

Tabela 13. Metoda procedury 3 - odzysk analitu (* dla wszystkich analitów / NDEA)

Analyte	Spiked concentration* (ng/mL)	NDMA (%)	NMBA (%)	NDEA (%)	NDEIPA (%)	NDIPA (%)
Walsartan	3.3 / 2,2	96,70	105,00	106.83	93.52	96.84
	16.6 / 11	94.72	95.50	102.50	80.52	82.79
	33.3 / 22.2	99.27	99.32	108.09	84.06	85.54
Losartan potasu	3.3 / 2.2	100.50	97.58	82.45	87.67	94.31
	16.6 / 11	103.25	97.19	109.20	92.29	96.04
	33.3 / 22.2	105.94	95.30	115.22	97.54	103.74

Podczas określania odzysku analitu zaobserwowano systematyczny problem z określeniem odzysku spike dla NDBA (dane nie pokazane), ponieważ znalezione stężenia tego analitu były zawsze zbyt wysokie (odzysk > 130%, a zatem wykluczone).

Analiza możliwych przyczyn tego problemu wykazała, że podczas elucji NDBA występuje koelucja z jedną lub kilkoma nieznanymi substancjami.

Wnioski

Niniejszy artykuł przedstawia intrygujące wyniki pracy z rozdziałem USP <1469>, Procedura 1 i udane wdrożenie Procedury 3 spełniającej wszystkie wymagania dotyczące przydatności systemu.

W celu oznaczenia N-nitrozoamin w walsartanie metodą GC-MS/MS zobacz artykuł Oznaczanie N-nitrozoamin w walsartanie

Więcej informacji na tematy związane z kontrolą jakości w farmacji można znaleźć na stronie SigmaAldrich.com/PharmaQC

Referencje

1. United States Pharmacopeia. 2022. General Chapter, <1469> Nitrosamine Impurities. USP-NF. Rockville, MD: United States Pharmacopeia. . https://doi.org/10.31003/uspnf_m15715_02_01