Imprint^® Zestaw do modyfikacji DNA (MOD50) Protokół

• Opis produktu
• Komponenty zestawu
  
• Przechowywanie/Stabilność
• Przebieg pracy
• Profil produktu
  
• Procedura
  
• Rozwiązywanie problemów
• Najczęściej zadawane pytania
  
• Materiały/li>
• Rozwiązywanie problemów
• Często zadawane pytania
  
• Materiały
• Materiały wymagane, a nie dostarczone
• Referencje

Opis produktu

Zestaw Imprint^® DNA Modification Kit zapewnia odczynniki potrzebne do konwersji wodorosiarczynu i oczyszczania próbek DNA po modyfikacji w czasie krótszym niż 2 godziny. Po obróbce, próbka DNA jest gotowa do dalszych analiz, takich jak sekwencjonowanie bisiarczynowe lub PCR specyficzny dla metylacji (MSP), który pozwala na rozróżnienie metylowanego i niemetylowanego DNA.

Wykazano, że metylacja DNA odgrywa ważną rolę w regulacji ekspresji genów. W dowolnym momencie około 70% wszystkich dinukleotydów CpG w genomie ssaków jest metylowanych.1 Hipo- i hipermetylacja w całym genomie przyczynia się do zmian w ekspresji genów.  Określenie statusu metylacji DNA jest ważnym narzędziem w badaniach epigenetycznych.^2,3

Protokół Imprint^® pozwala użytkownikowi na selektywną modyfikację DNA w taki sposób, że niemetylowane cytozyny są przekształcane w uracyl, podczas gdy metylowane cytozyny pozostają niezmienione. Dla optymalnej modyfikacji ilość DNA powinna mieścić się w zakresie 50-200 ng, ale z powodzeniem stosowano DNA w zakresie od 0,1 ng do 1 µg. Zmodyfikowane DNA wygenerowane z naszej procedury Imprint^® DNA Modification jest odpowiednie do stosowania w sekwencjonowaniu bisulfitowym, MSP, pirosekwencjonowaniu i mikromacierzach metylacyjnych.  

Komponenty zestawu - wystarczające na 50 reakcji

Tabela 1. Elementy zestawu.

Odczynnik	Numer katalogowy	50 Rxn
Proszek do modyfikacji DNA	D6943	5 fiolek
Roztwór modyfikujący DNA	D7068	6.5 mL
Roztwór równoważący	B5811	0.5 mL
Roztwór wychwytujący	M6695	20 mL
Przeciwciało czyszczące	M6945	3.5 mL
Roztwór do elucji	M6820	1.5 mL
Kolumna wirująca*	S2697	50 sztuk
Rurka zbiorcza bez korka, 2 ml	C3368	50 sztuk
Rurka zbiorcza, 1.5 ml	T3566	50 sztuk

Przechowywanie/Stabilność

Wszystkie składniki mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej. Każda fiolka DNA Modification Powder wystarcza na dziesięć modyfikacji DNA. Po rozpuszczeniu roztwór może być przechowywany w temperaturze -20 °C przez tydzień, z dala od światła. Przed użyciem zamrożony roztwór należy rozmrozić w temperaturze pokojowej i worteksować przez dwie minuty.

Workflow

Profil produktu

Zestaw Imprint^® DNA Modification Kit zawiera wszystkie odczynniki wymagane do bisiarczynowej konwersji DNA. Denaturacja DNA i modyfikacja wodorosiarczynem są przeprowadzane jednocześnie. W procesie modyfikacji, wodorosiarczyn reaguje specyficznie z jednoniciowym DNA w celu deaminacji cytozyny, tworząc resztę uracylu. Unikalne odczynniki chroniące DNA w buforze modyfikującym zapobiegają chemicznej i termofilnej degradacji DNA podczas obróbki wodorosiarczynem. Roztwór wychwytujący umożliwia ścisłe związanie DNA z filtrem kolumny. Pozwala to na skuteczne usunięcie pozostałości wodorosiarczynu sodu i soli. Wymyte zmodyfikowane DNA może być użyte natychmiast lub przechowywane w temperaturze -20 °C przez okres do 2 miesięcy.

Przygotowanie odczynników

• Roztwór czyszczący rozcieńczony etanolem - dodaj 8. 2 ml absolutnego etanolu do kolumny.2 ml absolutnego etanolu do butelki i wymieszać.
• 90% roztwór etanolu - dodać 500 µL wody do 4,5 ml absolutnego etanolu.
• Roztwór równoważący/roztwór płuczący etanolu - dodaj 10 µL roztworu równoważącego do 1,1 ml 90% etanolu.
  

Procedura

Protokół Imprint^® oferuje elastyczność jedno- lub dwuetapowej procedury modyfikacji. Jednoetapowa modyfikacja jest dołączona jako wygodniejsza procedura do stosowania z wyższym wkładem DNA (10 ng do 1 µg). Dwuetapowa procedura modyfikacji jest zalecana dla niskiego wkładu DNA (100 pg do 10 ng). Jako nośnika można użyć roztworu BSA o numerze katalogowym  B8667  (20 mg/mL) rozcieńczonego do 0,5 mg/mL (12,5 µL BSA na 487,5 µL wody). Roztwór BSA-woda poprawi odzyskiwanie DNA przy niskich stężeniach wejściowych.

Jednoetapowa procedura modyfikacji

1. Dodaj 1,1 ml roztworu do modyfikacji DNA do 1 fiolki z proszkiem do modyfikacji DNA. Worteksuj fiolkę przez 2 minuty lub do momentu, gdy roztwór stanie się klarowny. Sprawdź, czy w fiolce nie ma cząstek, które mogą się nie rozpuścić. Jeśli cząstki są obecne, należy inkubować fiolkę w temperaturze 65 °C przez 2 minuty i krótko worteksować. Dodaj 40 µL Roztworu Równoważącego i krótko worteksuj.
2. Dodaj 10 µL DNA do 1,5 ml probówki do mikrowirówki. Dodaj 110 µL roztworu z kroku 1 do probówki. Krótko wymieszaj. Inkubuj probówkę w temperaturze 99°C przez 6 minut.
3. Po inkubacji w kroku 2, natychmiast wykonaj inkubację w temperaturze 65°C przez 90 minut, a następnie przejdź do oczyszczania DNA po modyfikacji.

Dwuetapowa procedura modyfikacji

1. Dodaj próbkę DNA do 1,5 ml probówki mikrowirówki i dostosuj całkowitą objętość do 24 µL za pomocą wody lub przygotowanego 0,5 mg / ml roztworu BSA-woda. Dodać 1 µL roztworu Balance Solution. Worteksuj i inkubuj próbkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
2. Dodaj 1,1 ml Roztworu Modyfikującego DNA do 1 fiolki Proszku Modyfikującego DNA, worteksuj fiolkę przez 2 minuty lub do momentu, aż roztwór stanie się klarowny. Sprawdź fiolkę pod kątem obecności cząstek, które mogą nie zostać rozpuszczone. Jeśli cząstki są obecne, inkubuj fiolkę w temperaturze 65°C przez 2 minuty, a następnie krótko worteksuj. Dodaj 40 µL roztworu Balance Solution i krótko worteksuj.
3. Dodaj 125 µL przygotowanego roztworu z kroku 2 do próbki DNA po inkubacji w kroku 1. Worteksować i inkubować w temperaturze 65°C przez 90 minut.

Oczyszczanie DNA po modyfikacji

1. Umieść kolumnę wirówkową w probówce zbiorczej bez nakrętki - 2 ml na każdą próbkę, która została zmodyfikowana.
2. Dodaj 300 µL roztworu wychwytującego do kolumny wirówkowej i pozostaw roztwór na kolumnie przez 1 minutę.
   Uwaga: Zawsze zakrywaj kolumny wirówkowe przed umieszczeniem ich w mikrowirówce.
3. Dodaj zmodyfikowany roztwór DNA z kroku 3 procedury modyfikacji DNA na kolumnę wirówkową zawierającą już roztwór wychwytujący. Wirować kolumnę z prędkością 12 000 x g przez 20 sekund. Uwaga: Wszystkie wirowania odbywają się przy 12 000 x g
4. Dodaj 200 µL Roztworu Czyszczącego rozcieńczonego etanolem do kolumny wirówkowej i wiruj przez 20 sekund.
5. Dodaj 50 µL Roztworu Płuczącego Balance/Ethanol na dno kolumny wirówkowej. Upewnij się, że pęcherzyki powietrza nie utrudniają przepływu cieczy do filtra kolumny. Inkubować 8 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji odwiruj przez 20 sekund i odrzuć przepływającą ciecz.
6. Dodaj 200 µL 90% roztworu etanolu do kolumny wirówkowej i odwiruj przez 20 sekund, a następnie odrzuć przepływającą ciecz.
7. Dodaj 200 µL 90% roztworu etanolu do kolumny wirówkowej i odwiruj przez 40 sekund. Odrzuć bezkapsułkową probówkę zbiorczą o pojemności 2 ml i umieść kolumnę wirówkową w probówce zbiorczej o pojemności 1,5 ml.
8. Dodaj 8-20 µL roztworu elucyjnego na dno kolumny wirówkowej. Pozostaw roztwór do inkubacji na 1 minutę, a następnie odwiruj przez 20 sekund. Usuń kolumnę spinową i wyrzuć ją. Wymywany roztwór to zmodyfikowane DNA. Zmodyfikowane DNA jest teraz gotowe do dalszych testów lub może być przechowywane w temperaturze -20 °C przez okres do 2 miesięcy.
   

Rysunek 1 Modyfikację dwusiarczynem przeprowadzono na malejących stężeniach ludzkiego genomowego DNA przy użyciu Imprint^® MOD50 oraz zestawów od dwóch innych dostawców. Następnie przeprowadzono PCR specyficzny dla metylacji (MSP) na wszystkich próbkach przy użyciu starterów specyficznych dla genu β-aktyny (amplikon 109 bp). Dla wszystkich dostawców pasy od lewej do prawej to odpowiednio 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 50 pg i brak próbki. Dostawcy C i D (nie pokazani) nie mają produktu przy 50 pg. Wyniki te pokazują doskonałą czułość zestawu Imprint^® w porównaniu do innych dostawców.

Rozwiązywanie problemów

Obserwacja	Przyczyna	Zalecane rozwiązanie
DNA jest słabo zmodyfikowane	Początkowe DNA nie jest oczyszczone lub pofragmentowane	Upewnij się, że stosunek DNA A260/280 wynosi między 1.6-1,9 DNA można sprawdzić pod kątem degradacji za pomocą elektroforezy żelowej. Rozpocznij analizę z wysokiej jakości DNA.
	Niewystarczająca ilość DNA	Zwiększ początkową ilość DNA do zalecanej ilości.
	Szablon DNA zawiera wysoką zawartość GC lub strukturę drugorzędową	Zwiększ czas reakcji wodorosiarczynu do 150-180 minut.
	Niewystarczająca denaturacja DNA	Upewnij się, że do próbki dodano wystarczającą ilość roztworu równoważącego
	Nieprawidłowa temperatura	Sprawdź temperaturę inkubacji
	Niewystarczające czyszczenie DNA	Upewnij się, że do 90% etanolu dodano wystarczającą ilość roztworu równoważącego
	.Nieprawidłowe przechowywanie mieszaniny proszku do modyfikacji DNA/roztworu do modyfikacji DNA/roztworu równoważącego	Upewnij się, że mieszanina jest przechowywana w temperaturze -20 °C i nie ma więcej niż 1 tydzień.
Elucja zawiera mało DNA lub nie zawiera go wcale	Niska jakość wyjściowego DNA	Sprawdź, czy DNA jest degradowane przez elektroforezę żelową.
	Roztwór wychwytujący nie został dodany do próbki	Dodaj roztwór wychwytujący, jak wskazano w kroku 2 Oczyszczania DNA po modyfikacji.
	Roztwór czyszczący rozcieńczony etanolem jest przygotowywany z 70% etanolem, a nie absolutnym etanolem	Przed użyciem upewnij się, że do roztworu czyszczącego dodano odpowiednią objętość absolutnego etanolu.
	Przygotowanie roztworu do płukania z równowagą/etanolem jest nieprawidłowe	Odnieś się do sekcji Przygotowanie odczynnika.
	Kolumna nie jest przemywana 90% etanolem	Sprawdź, czy roztwór przemywający zawiera 90% etanolu
&Próbka nie przeszła całkowicie przez filtr	Oczyść DNA przed modyfikacją i zwiększ czas wirowania do 1 minuty dla wszystkich etapów wirowania
Elucja zawiera zarówno niezmodyfikowane, jak i zmodyfikowane DNA	Ilość DNA jest poza zalecanym zakresem	Dostosuj ilość wyjściowego DNA do zakresu 50-200 ng
	Szablon zawiera wysoką zawartość GC	Zwiększ czas reakcji wodorosiarczynu do 150-180 minut

Często zadawane pytania

Jaka jest różnica między jednoetapową a dwuetapową modyfikacją DNA?

W jednoetapowej modyfikacji DNA, DNA jest denaturowane przez ogrzewanie, co pozwala na jednoczesną denaturację DNA i modyfikację wodorosiarczynem. Ponieważ jednoetapowa modyfikacja DNA może zwiększyć degradację DNA, procedura ta najlepiej nadaje się do większych ilości DNA (od 10 ng do 1 µg).  W dwuetapowej modyfikacji DNA, DNA jest denaturowane chemicznie, a następnie poddawane działaniu wodorosiarczynu. Ta procedura jest zalecana dla niższych ilości wejściowych (100 pg do 10 ng). Oba zestawy są odpowiednie do modyfikacji przy użyciu DNA wyizolowanego z różnych źródeł.

Jaka ilość początkowego DNA jest wymagana do modyfikacji DNA za pomocą tego zestawu?

Początkowe DNA wymagane do modyfikacji DNA może wynosić zaledwie 50 pg. Sygnał zmodyfikowanego DNA można wykryć za pomocą PCR w czasie rzeczywistym.

Dlaczego tylko 90 minut jest wymagane do modyfikacji DNA?

Dzięki naszemu unikalnemu składowi modyfikacji, 90 minut wystarcza na ponad 99% konwersji C-U, podczas gdy degradacja DNA jest znacznie ograniczona. Zaobserwowaliśmy, że wydłużenie czasu modyfikacji nie zwiększyło znacząco konwersji C-U, podczas gdy wydajność zmodyfikowanego DNA została znacznie zmniejszona, najprawdopodobniej z powodu zwiększonej degradacji DNA.

Jak długo można przechowywać zmodyfikowane DNA?

Zmodyfikowane DNA wygenerowane za pomocą tego zestawu może być przechowywane przez 2 miesiące w temperaturze -20 °C, 6 miesięcy w temperaturze -80 °C.

Czy zestaw może być używany do modyfikacji DNA wyizolowanego z próbek utrwalonych formaliną i zatopionych w parafinie (FFPE)?

Tak. Należy jednak pamiętać, że niektóre protokoły utrwalania poważnie degradują DNA. Dlatego zalecamy użytkownikowi próbę amplifikacji interesującego genu przed obróbką dwusiarczynem. Jeśli gen może być amplifikowany, zalecamy dwuetapowy protokół dla próbek FFPE. Zestaw do modyfikacji dwusiarczynem Imprint zawiera odczynniki stabilizujące DNA, które minimalizują degradację próbki.

Materiały wymagane nie dostarczone

• E7023
• W4502

Środki ostrożności i zastrzeżenia

Ten produkt jest przeznaczony wyłącznie do użytku badawczego. Nie jest przeznaczony i nie powinien być używany do celów terapeutycznych lub diagnostycznych u ludzi lub zwierząt. Każde takie nieautoryzowane użycie będzie stanowić naruszenie praw własności Epigentek Group Inc. Informacje dotyczące zagrożeń i bezpiecznego obchodzenia się z produktem znajdują się w karcie charakterystyki.

Imprint jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy i/lub jej podmiotów stowarzyszonych.

Imprint jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy i/lub jej podmiotów stowarzyszonych.

Referencje

1. Afzali M, Nakhaee A, Tabatabaei SP, Tirgar-Fakheri K, Hashemi M. 2013. Aberrant Promoter Methylation Profile of Niemann-Pick Type C1 Gene in Cardiovascular Disease. [Internet]. Iran: Iranian Biomedical Journal. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3677679/

2. Lee HY, Park MJ, An JH, Yang WI, Shin K. 2011. Potential forensic application of DNA methylation profiling to body fluid identification. [Internet]. Seoul, South Korea: International Journal of Legal Medicine. Available from: https://link.springer.com/article/10.1007/s00414-011-0569-2

3. Follo MY, Russo D, Finelli C, Mongiorgi S, Clissa C, Filì C, Colombi C, Gobbi M, Manzoli L, Piazzi M, et al. 2012. Epigenetic regulation of nuclear PI-PLCbeta1 signaling pathway in low-risk MDS patients during azacitidine treatment. Leukemia. 26(5):943-950. https://doi.org/10.1038/leu.2011.300

4. Ruchat S, Houde A, Voisin G, St-Pierre J, Perron P, Baillargeon J, Gaudet D, Hivert M, Brisson D, Bouchard L. 2013. Gestational diabetes mellitus epigenetically affects genes predominantly involved in metabolic diseases. Epigenetics. 8(9):935-943. https://doi.org/10.4161/epi.25578

5. Huffman SR, Almamun M, Rivera RM. 2012. Isolation of RNA and DNA from Single Preimplantation Embryos and a Small Number of Mammalian Oocytes for Imprinting Studies.201-209. https://doi.org/10.1007/978-1-62703-011-3_13

6. Ideraabdullah FY, Abramowitz LK, Thorvaldsen JL, Krapp C, Wen SC, Engel N, Bartolomei MS. 2011. Novel cis-regulatory function in ICR-mediated imprinted repression of H19. Developmental Biology. 355(2):349-357. https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2011.04.036

7. Follo MY, Finelli C, Mongiorgi S, Clissa C, Chiarini F, Ramazzotti G, Paolini S, Martinelli G, Martelli AM, Cocco L. 2011. Synergistic induction of PI-PLC?1 signaling by azacitidine and valproic acid in high-risk myelodysplastic syndromes. Leukemia. 25(2):271-280. https://doi.org/10.1038/leu.2010.266

8. Kurian JR, Keen KL, Terasawa E. 2010. Epigenetic Changes Coincide with in Vitro Primate GnRH Neuronal Maturation. 151(11):5359-5368. https://doi.org/10.1210/en.2010-0555

9. Shen L, Guo Y, Chen X, Ahmed S, Issa JJ. 2007. Optimizing annealing temperature overcomes bias in bisulfite PCR methylation analysis. BioTechniques. 42(1):48-58. https://doi.org/10.2144/000112312

10. Beier V, Mund C, Hoheisel JD. Monitoring Methylation Changes in Cancer.1-11. https://doi.org/10.1007/10_024

11. Leone G, Teofili L, Voso MT, Lübbert M. 2002. DNA methylation and demethylating drugs in myelodysplastic syndromes and secondary leukemias. [Internet]. Rome, Italy: National Library of Medicine. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12495905/

12. Shen L, Guo Y, Chen X, Ahmed S, Issa JJ. 2007. Optimizing annealing temperature overcomes bias in bisulfite PCR methylation analysis. BioTechniques. 42(1):48-58. https://doi.org/10.2144/000112312

13. Beier V, Mund C, Hoheisel JD. Monitoring Methylation Changes in Cancer.1-11. https://doi.org/10.1007/10_024