Dobre praktyki bankowości komórkowej

ECACC Laboratory Handbook 4th Edition

Złą praktyką jest utrzymywanie linii komórkowej w ciągłej lub przedłużonej hodowli z następujących powodów:

• Ryzyko skażenia mikrobiologicznego
• Utrata cech będących przedmiotem zainteresowania (np. ekspresja antygenu powierzchniowego lub przeciwciała monoklonalnego)
• Dryf genetyczny, szczególnie w przypadku komórek o niestabilnym kariotypie (np.antygenu powierzchniowego lub ekspresji przeciwciał monoklonalnych)
• Dryf genetyczny, szczególnie w komórkach o niestabilnym kariotypie (np.CHO, BHK 21)
• Utrata linii komórkowej z powodu przekroczenia skończonej długości życia (np. ludzkie komórki diploidalne, takie jak MRC-5)
• Ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego z innymi liniami komórkowymi
• Zwiększone koszty materiałów eksploatacyjnych i personelu

Wszystkie te potencjalne czynniki ryzyka można zminimalizować poprzez wdrożenie systemu bankowania komórek. Ten rodzaj systemu jest znany jako wielopoziomowy system bankowania lub główny system bankowania komórek. Po pierwszym przybyciu do laboratorium, nowa kultura komórkowa powinna być traktowana jako potencjalne źródło zanieczyszczenia (np. zawierające bakterie, grzyby i mykoplazmę i powinna być traktowana w warunkach kwarantanny do czasu uzyskania negatywnego wyniku dla takich zanieczyszczeń mikrobiologicznych).

Tiered Cell Banking System

Po pozyskaniu nowej linii komórkowej należy pobrać 3-5 ampułek i zamrozić je jako zapas symboliczny przed przygotowaniem głównego banku komórek. Przetestuj jedną z ampułek na obecność mykoplazmy - jeśli ten test zakończy się niepowodzeniem, zrezygnuj z procedury bankowania. Jeśli komórki pomyślnie przejdą test na obecność mykoplazmy, należy reanimować jedną z ampułek i rozszerzyć jej hodowlę w celu stworzenia głównego banku komórek składającego się z 10-20 ampułek, w zależności od przewidywanego poziomu wykorzystania. Za każdym razem, gdy ampułka jest rozmrażana z banku wzorcowego, należy przeprowadzić testy kontroli jakości komórek. Testy te obejmują liczbę i żywotność komórek, testy QC na obecność mykoplazmy i innych drobnoustrojów oraz uwierzytelnienie linii komórkowej. Jeśli komórki nie przejdą testów, procedurę bankowania należy powtórzyć. Jeśli komórki pomyślnie przejdą testy, można je reanimować i rozszerzyć w hodowli. Komórki te można wykorzystać do utworzenia banku roboczego poprzez kriokonserwację; powinien on obejmować 20-200 ampułek. Ampułki te mogą być wykorzystywane do celów hodowlanych i eksperymentalnych, ale testy kontroli jakości należy powtórzyć przed ich użyciem.

2-3 ampułki z tego głównego banku komórek powinny zostać przydzielone do kontroli jakości potwierdzającej, że liczba komórek i żywotność banku są akceptowalne oraz że bank jest wolny od bakterii, grzybów i mykoplazmy. Na tym etapie ważne jest również uwierzytelnienie głównego banku komórek poprzez profilowanie STR, kodowanie paskowe DNA lub analizę SNP. Wymagane są również dodatkowe testy, takie jak badania wirusologiczne. Po pomyślnym zakończeniu tych testów ampułka z głównego banku komórek powinna zostać rozmrożona i poddana hodowli w celu utworzenia działającego banku komórek. Wielkość tego banku będzie ponownie zależeć od przewidywanego poziomu zapotrzebowania. Testy kontroli jakości (liczba komórek, żywotność, uwierzytelnianie i brak zanieczyszczeń mikrobiologicznych) są ponownie wymagane przed użyciem kultur do rutynowych eksperymentów lub produkcji.

Uwaga: Uwierzytelnij główny i roboczy bank komórek za pomocą profilowania STR, kodowania paskowego DNA lub analizy SNP.

Wdrożenie tego systemu bankowego zapewnia:

• Materiał jest spójnej jakości
• Eksperymenty są przeprowadzane przy użyciu kultur w tym samym zakresie numerów pasażu
• Komórki są w kulturze tylko wtedy, gdy jest to wymagane
• Oryginalne cechy linii komórkowych są identyczne.li>Charakterystyka oryginalnej linii komórkowej jest zachowana

Uwagi

1. Liczba ampułek przygotowanych dla głównego i roboczego banku komórek zależy od prognozowanego zapotrzebowania na ich wykorzystanie.
2. Liczba ampułek pobranych do kontroli jakości zależy od wielkości banku. Idealnie, 5% banku powinno zostać przetestowane przed użyciem.
3. Ampułki z roboczego banku komórek powinny być używane sekwencyjnie, utrzymując komórki w hodowli nie dłużej niż przez określoną liczbę podwojeń komórek. Liczba ta będzie najmniejsza w przypadku linii komórkowych o skończonej długości życia (np. linie diploidalne).
4. Pracujący bank komórek powinien być uzupełniany z ampułki z głównego banku komórek. Powinno to być wykonane w czasie wystarczającym do zakończenia kontroli jakości.
5. Nowy główny bank komórek powinien być przygotowany zanim liczba oryginalnych zapasów głównych spadnie poniżej pięciu ampułek.
6. Panel przeprowadzanych testów kontroli jakości zależy od zamierzonego zastosowania, np. organy regulacyjne mogą wymagać dodatkowych testów, takich jak badania przesiewowe wirusów i badania kariotypowe.