Rozwiązywanie problemów związanych z zanieczyszczeniem hodowli komórkowych

Przegląd
Rodzaje zanieczyszczeń
Wspólne przyczyny i zapobieganie zanieczyszczeniom
   Drobnoustroje (bakterie, grzyby, drożdże)
   Mycoplasma
&  zanieczyszczenie wirusowe
   Skażenie chemiczne
Ogólne wskazówki i techniki
   Praca w komorze bezpieczeństwa biologicznego
   Zapobieganie powstawaniu aerozoli
   Dezynfekcja
   Jak przeprowadzać rutynowe monitorowanie zdrowych komórek

Zanieczyszczenie hodowli: Przegląd

Chociaż "zanieczyszczenie hodowli komórkowej" zazwyczaj kojarzy się z bakteriami wśród komórek i mętnymi mediami, niechciani najeźdźcy w kolbie hodowlanej mogą przybierać różne formy. Zanieczyszczenia wirusowe i chemiczne mogą mieć również poważne konsekwencje dla zdrowia hodowli, a zapewnienie, że linie komórkowe nie są zanieczyszczone krzyżowo, ma kluczowe znaczenie dla powtarzalności wyników.

Jak powszechne jest zanieczyszczenie komórek? Na podstawie badań przeprowadzonych przez FDA, ATCC i innych szacuje się, że 5-30% wszystkich dzisiejszych hodowli komórkowych jest zanieczyszczonych tylko gatunkami mykoplazmy. Częstość występowania skażenia wirusowego popularnych linii komórkowych przekroczyła 25% w jednym z badań⁵, a wirusy niecytopatyczne są nawet bardziej prawdopodobne niż mykoplazma, aby uniknąć wykrycia, ponieważ zdrowie kultury może nie dostarczać wskazówek na temat ich obecności.

Rysunek 1. Zanieczyszczenie komórek

Kluczem do kontrolowania określonego zanieczyszczenia jest czasami łatwość jego wykrycia. Zanieczyszczenia bakteryjne, grzybicze i drożdżowe są często widoczne nieuzbrojonym okiem i mogą szybko zabijać komórki w hodowli, ale subtelna morfologia może utrudniać identyfikację znaczących intruzów mikrobiologicznych, takich jak mykoplazma. Dla porównania, wirusy nie mogą być w ogóle wykryte za pomocą konwencjonalnej mikroskopii świetlnej, a ich odkrycie jest często spowodowane obserwacjami niewyjaśnionego oderwania lub innych oznak słabego zdrowia komórek, a nawet ich śmierci.

Jednym z najważniejszych problemów, z jakimi boryka się społeczność biologów w ostatnich latach, jest zanieczyszczenie lub nawet błędna identyfikacja badawczych linii komórkowych. Więcej informacji na ten ważny temat można znaleźć w kliknij tutaj, aby zrozumieć przyczyny i częstość występowania zanieczyszczonych krzyżowo linii komórkowych oraz jak ocenić integralność tożsamości linii komórkowej.

Types of Culture Contamination

Bacteria, Fungi, Yeast:

Zanieczyszczenia bakteryjne, grzybicze (w tym pleśnie) i drożdżowe są zwykle widoczne nieuzbrojonym okiem jako szybko pojawiające się zmętnienie i zmiana koloru podłoża hodowlanego (pod warunkiem, że podłoże jest uzupełnione czerwienią fenolową, najpopularniejszym nietoksycznym wskaźnikiem pH). Standardowa mikroskopia świetlna ujawni również komórki bakteryjne i struktury grzybów, więc codzienna obserwacja mikroskopowa kultur zapewni wczesne wykrycie skażenia mikrobiologicznego i umożliwi podjęcie odpowiednich działań, gdy tylko pojawią się pierwsze oznaki. W szczególności konieczne jest szybkie usuwanie skażonych hodowli w celu ochrony sąsiednich hodowli, a także sterylnego środowiska hodowli tkanek, w tym inkubatorów hodowli, łaźni i szafy bezpieczeństwa biologicznego. Dodatkowo, specyficzne testowanie na obecność bakterii i grzybów powinno być stosowane jako część rutynowej i regularnej procedura kontroli jakości.

Commonous Causes and Prevention of Microbial Contamination

.

Przyczyna źródłowa	Zapobieganie
Technika./th>	Zapobieganie
Technika:
Manipulacje, pipetowanie, dozowanie
Niesterylne powierzchnie i sprzęt	Obszar roboczy należy oczyścić z przedmiotów niebędących w bezpośrednim użyciu.
Rozlane płyny na szyjkach i na zewnątrz butelek oraz na powierzchni roboczej	Regularnie przecierać 70% alkoholem. Nie wylewać płynów. Dozować za pomocą pipety, automatycznego dozownika lub urządzenia transferowego. Jeśli nalewanie jest nieuniknione: (1) zrób to jednym płynnym ruchem, (2) wyrzuć butelkę, z której nalewasz.
Dotykanie lub trzymanie pipety zbyt blisko końcówki, dotykanie szyjek butelek, wewnątrz zakrętek	Trzymaj pipety powyżej podziałki. Obsługuj sterylne pipety za pomocą rękawa.
Odpady ze zlewki na odpady	Odpady usuwaj do zlewki za pomocą lejka lub, jeśli to możliwe, używaj podciśnienia do usuwania odpadów.
Pył osadowy lub cząstki skóry osadzające się na hodowli lub butelce; ręce lub aparatura trzymane nad otwartą płytką, butelką, naczyniem	Nigdy nie podawać rąk, pracować nad otwartymi naczyniami Nie pracować nad (pionowy przepływ laminarny i otwarta ławka) lub za i nad (poziomy kaptur laminarny) otwartą butelką lub naczyniem.
Włosy, ręce, oddech, ubranie operatora
Pył ze skóry, włosów lub odzieży upuszczony lub wdmuchnięty do hodowli	Dokładnie umyć ręce, nosić niestrzępiący się fartuch laboratoryjny. Należy używać fartucha laboratoryjnego przeznaczonego wyłącznie do pomieszczeń hodowlanych. Długie włosy należy związać do tyłu lub nosić czapkę. Odwracaj twarz od miejsca pracy, gdy rozmowa jest konieczna.
Aerozole z rozmów, kaszlu, kichania itp.	Unikaj pracy z przeziębieniem lub noś maskę.
Materiały i odczynniki.
Rozwiązania
Niesterylne odczynniki i media	Filtr lub autoklawuj roztwory przed użyciem.
Niewłaściwe procedury sterylizacji	Monitoruj działanie autoklawu za pomocą termometru rejestrującego lub wskaźnika sterylności. Testuj lub hoduj wysterylizowane roztwory, jeśli podejrzewasz zanieczyszczenie.
Niedostateczna kontrola jakości u dostawcy komercyjnego	Zdobądź media, bufory, surowice tylko od renomowanych dostawców, którzy poświadczają jakość i źródło.
Glassware and screw caps
Pył i zarodniki z przechowywania	Zakryj zakrętki folią. Przetrzyj butelki 70% alkoholem przed przeniesieniem ich do wyciągu.
Instrumenty, pipety
Niezawodna sterylność	Używaj indywidualnie zapakowanych, sterylnych, jednorazowych materiałów eksploatacyjnych od renomowanego dostawcy. Przed użyciem sterylizuj przedmioty wielokrotnego użytku za pomocą suchego ciepła.
Kontakt z niesterylną powierzchnią lub innym materiałem	Nie chwytaj żadnej części instrumentu lub pipety, która przejdzie do naczynia hodowlanego.
Kolby hodowlane i butelki z pożywką w użyciu
Pył i zarodniki z inkubatora lub lodówki	Używaj zakrętek zamiast korków. Wymazać butelki przed umieszczeniem w okapie.
Zabrudzone warunki przechowywania lub inkubacji	Przykryj nakrętki i szyjki butelek folią aluminiową podczas przechowywania lub inkubacji. Regularnie czyść magazyny i inkubatory.
Media pod nakrętką i rozprzestrzeniające się na zewnątrz butelki	Odrzuć wszystkie butelki, które wykazują wyciek na zewnątrz szyjki. Nie wylewać.
Sprzęt i udogodnienia
Powietrze w pomieszczeniu
Przeciągi, wiry, turbulencje, kurz, aerozole &	Wyznacz odpowiednią przestrzeń do hodowli tkanek/komórek Ogranicz ruch i aktywność osób postronnych. Regularnie wycieraj podłogę i powierzchnie robocze.
Szafy biologiczne z przepływem laminarnym
Filtr perforowany	Regularnie sprawdzaj filtry pod kątem dziur i nieszczelności.
Zabrudzony filtr	Sprawdź spadek ciśnienia na filtrze.
Rozlania, szczególnie w szczelinach lub pod powierzchnią roboczą	Regularnie dezynfekuj wokół i pod powierzchnią roboczą. Pozwól alkoholowi spłynąć do szczelin.
CO2 nawilżane inkubatory
Rozwój pleśni i bakterii na ścianach i półkach w wilgotnej atmosferze	Czyść regularnie zgodnie ze specyfikacjami producenta z odpowiednią dezynfekcją.
Zarodniki itp, przenoszone w wymuszonym obiegu powietrza	Zamknij otwarte naczynia w plastikowych pudełkach z dopasowanymi pokrywkami (ale nie uszczelniaj pokrywek).
Wanny i inny sprzęt
Zanieczyszczenie w łaźniach wodnych używanych do podgrzewania roztworów &		Czyścić i dezynfekować łaźnie wodne regularnie; dokładnie wytrzeć naczynia 70% alkoholem przed przeniesieniem do szafy bezpieczeństwa biologicznego w celu użycia po wyschnięciu.
Kurz na butlach gazowych, pompach itp.	Rozważ użycie kąpieli rozgrzewającej nie opartej na wodzie (perełkowej). Przetrzeć 70% alkoholem przed wejściem do pomieszczenia hodowlanego.
Import materiałów biologicznych
.Przychodzące linie komórkowe
Podejrzenie skażenia u źródła lub podczas transportu	Należy obchodzić się z tymi liniami komórkowymi samodzielnie, najlepiej w kwarantannie. Sprawdź, czy nie doszło do skażenia, hodując kulturę przez dwa tygodnie bez antybiotyków. Sprawdź zanieczyszczenie wizualnie, za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym i barwienia Hoechst/DAPI dla mykoplazmy.

Mycoplasma

.

Mycoplasma to rodzaj bakterii, które nie posiadają ścian komórkowych, a zatem nie mają na nie wpływu antybiotyki, które ograniczają wzrost bakterii poprzez hamowanie tworzenia ścian komórkowych. Ich elastyczna morfologia i rozmiar komórek w zakresie od 0,15 do 0,3 µm oznaczają, że mogą one uniknąć standardowych metod filtracji hodowli komórkowych, które często wykorzystują filtry o porach 0,22 µm. W przeciwieństwie do większości innych zanieczyszczeń bakteryjnych, mykoplazmy nie będą widoczne przy zwykłej inspekcji i są trudne do wykrycia pod mikroskopem świetlnym ze względu na ich morfologię i szczególnie mały rozmiar. Miano mykoplazmy w hodowli może osiągnąć 10⁸ organizmów/ml bez powodowania zmętnienia pożywki. Zwykle nie zabijają komórek ssaków, które infekują, ale znacząco wpływają na kultury poprzez zmianę metabolizmu komórkowego, powodowanie aberracji chromosomalnych, spowolnienie wzrostu komórek i zakłócanie przyłączania komórek. Krótko mówiąc, mogą one znacząco wpływać na wyniki większości eksperymentów przeprowadzanych przy użyciu zainfekowanych linii komórkowych.

Rysunek 2. Powszechnie stosowane środki do wykrywania DNA, takie jak DAPI lub Hoechst, ujawniają obecność mykoplazmy w zakażonych kulturach (po prawej) przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Różnorodne źródła skażenia mykoplazmą w laboratorium mogą stanowić wyzwanie. Ponieważ niektóre gatunki mykoplazmy występują na ludzkiej skórze, mogą one zostać wprowadzone poprzez niewłaściwą technikę aseptyczną, a także poprzez skażone suplementy, takie jak płodowa surowica bydlęca.  Mykoplazmy są wysoce zakaźne wśród sąsiednich skażonych kultur komórkowych. Filtrowanie mediów i buforów za pomocą membran o porach 0,1 µm lub mniejszych jest konieczne do leczenia mykoplazm, ponieważ standardowe urządzenia do filtracji mediów o porach 0,22 lub 0,45 µm nie wykluczą tych małych organizmów.

Zapobieganie, wykrywanie i eliminowanie skażenia mykoplazmą

Gdy mykoplazma zanieczyści hodowlę, może szybko rozprzestrzenić się na inne obszary laboratorium. Ścisłe przestrzeganie dobre praktyki laboratoryjne są kluczowe, a rutynowe badania na obecność mykoplazmy są wysoce zalecane dla skutecznej kontroli skażenia mykoplazmą. Trzy najpopularniejsze metody wykrywania to hodowla mykoplazmy, metoda barwienia DNA i Wykrywanie oparte na PCR.Oferujemy różnorodne rozwiązania do  wykrywania i eliminacji mykoplazmy. Niezwykle ważne jest ustanowienie rutynowego badania przesiewowego kultur mykoplazmy, nawet jeśli nie podejrzewasz obecności tego zanieczyszczenia w laboratorium.

Zapobieganie skażeniu mikrobiologicznemu:  czy antybiotyki są odpowiedzią? Jednym z nich w hodowli tkankowej jest rutynowe stosowanie antybiotyków, zarówno pojedynczo, jak i w koktajlach z lekami przeciwgrzybiczymi. Podobnie jak w przypadku antybiotyków terapeutycznych przepisywanych przez lekarzy, ciągłe lub niewłaściwe stosowanie antybiotyków może prowadzić do rozwoju opornych szczepów, które są trudne do wyeliminowania i mogą wymagać stosowania antybiotyków późniejszej generacji, które mogą być toksyczne dla kultur komórkowych. Ostatnie badania wzbudziły dodatkowe obawy dotyczące możliwości zmiany ekspresji genów w hodowanych komórkach w obecności antybiotyków.

Zanieczyszczenia wirusowe

.Wirusy są jednymi z najtrudniejszych do wykrycia zanieczyszczeń w hodowli komórkowej, wymagającymi metod mikroskopowych, które byłyby niepraktyczne dla większości laboratoriów badawczych. Mogą one pochodzić ze źródła komórek pacjenta lub zwierzęcia-gospodarza, a kilka linii komórkowych o znaczeniu biotechnologicznym zawiera endogenne retrowirusy. Częściej komórki są infekowane przez wirusy obecne w materiałach pochodzenia zwierzęcego wykorzystywanych do ich hodowli. Niewielki rozmiar wirusów sprawia, że są one bardzo trudne do usunięcia z pożywek, surowic i innych roztworów pochodzenia biologicznego. Jednakże, ponieważ większość wirusów jest ograniczona do gospodarza, a nawet tkanki, może to ograniczać ich zdolność do infekcji międzygatunkowej lub międzytkankowej. Chociaż wirusy mogą być bardziej powszechne w hodowlach komórkowych, niż wielu badaczy zdaje sobie sprawę, mogą one lub nie mogą stanowić znaczącego czynnika zakłócającego hodowlę komórkową, jeśli nie wywołują cytopatii lub innych niekorzystnych skutków dla komórek.

Poza ich potencjałem do wpływania na hodowane komórki, główną obawą związaną z wykorzystaniem zakażonych wirusami kultur komórkowych jest potencjalne zagrożenie dla zdrowia personelu laboratoryjnego. Specjalne środki ostrożności powinny być zawsze stosowane podczas pracy z tkankami lub komórkami pochodzącymi od ludzi lub innych naczelnych, aby uniknąć możliwego przeniesienia infekcji wirusowej (HIV, wirus zapalenia wątroby typu B, wirus Epsteina-Barr, wirus opryszczki pospolitej typu B, między innymi) z hodowli komórkowych na personel laboratoryjny. Instytucjonalni urzędnicy ds. bezpieczeństwa środowiskowego powinni być konsultowani w sprawie procedur pracy z potencjalnie niebezpiecznymi tkankami, kulturami lub wirusami. Aby uzyskać więcej informacji na temat oceny ryzyka dla personelu laboratoryjnego pracującego z kulturami komórkowymi, kliknij tutaj

Najlepsze praktyki w celu zmniejszenia częstości występowania kontaminacji wirusowej kultur komórkowych:
*Ograniczyć liczbę źródeł biologicznych (dostawców, zwierząt), z których pobierane są komórki.
*Wybierać zwierzęta/komórki, które są mniej podatne na wirusy.
*Wybieraj komórki z repozytoriów, które przeprowadzają testy na obecność wirusów i zapewniają certyfikację linii komórkowych wolnych od wirusów.

.Zanieczyszczenie chemiczne

Każde nieożywione zanieczyszczenie hodowli komórkowej jest często klasyfikowane jako zanieczyszczenie "chemiczne".Zanieczyszczenia te mogą pochodzić z odczynników lub wody stosowanej w pożywkach lub buforach, lub ze sprzętu i materiałów eksploatacyjnych.  Przykłady obejmują wolne rodniki, jony metali, pozostałości środków dezynfekujących/detergentów, a nawet endotoksyny, które utrzymują się po tym, jak zanieczyszczenia bakteryjne nie są już obecne.

Wskazówki dotyczące zapobiegania zanieczyszczeniom chemicznym:
*Zawsze używaj wody klasy laboratoryjnej do przygotowywania buforów i roztworów oraz ponownego zawieszania liofilizowanych odczynników.
*Wszelkie naczynia laboratoryjne wielokrotnego użytku muszą być dokładnie wypłukane i wysuszone na powietrzu - autoklawowanie nie ma wpływu na pozostałości detergentu.
*Pożywki, suplementy i surowicę (FBS, FCS) należy pozyskiwać wyłącznie od dostawców, którzy posiadają certyfikat badania na obecność endotoksyn.

Ogólne wskazówki i techniki zapobiegania i eliminacji zanieczyszczeń

Praca w szafie bezpieczeństwa biologicznego

Podczas pracy w szafie bezpieczeństwa biologicznego warto pamiętać, że przepływ powietrza ma kluczowe znaczenie dla utrzymania sterylnego środowiska. Zarówno tylne, jak i przednie otwory wentylacyjne powinny być zawsze drożne, aby zapewnić skuteczny przepływ powietrza. Przed każdą praktyczną procedurą szafa powinna być zaopatrzona we wszystkie wymagane materiały, aby zminimalizować możliwość przeniesienia zanieczyszczeń na rękawy i dłonie operatora.

Przed umieszczeniem przedmiotów, które mają być używane w szafie, powinno upłynąć co najmniej dwadzieścia minut od rozpoczęcia przepływu powietrza. Wszystkie przedmioty, które trafiają do szafy, należy najpierw spryskać sterylnym alkoholem 70% (v/v) i wytrzeć chusteczkami jednorazowego użytku, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu i cząstek stałych do szafy. Upewnij się, że przepływ powietrza jest dobrze ustanowiony przed otwarciem jakichkolwiek pokryw lub pojemników, aby umożliwić przepływ powietrza w celu oczyszczenia obszaru roboczego z cząstek stałych, które mogły zostać wprowadzone.

Rysunek 3. Praca w szafce bezpieczeństwa

.Pipetowanie i zapobieganie aerozolom

Jednorazowe pipety plastikowe - zwane również pipetami serologicznymi, dostępne w pojemnościach od 1-100 ml - są niezbędnymi narzędziami do hodowli komórkowej. Muszą być one indywidualnie pakowane, aby zapewnić sterylność. Przestrzeganie poniższych wskazówek może zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia i bezpieczeństwa związane z pipetowaniem.

• Używaj automatycznych pipet, przy czym każda pipeta może być używana tylko w jednej szafce. Aby uniknąć zanieczyszczenia, regularnie demontuj i dezynfekuj części pipety. Upewnij się, że filtry do pipet są dobrze zaopatrzone i regularnie wymieniane.
• Używaj zatkanych pipet (zatkanych od góry bawełną), gdy tylko jest to możliwe, zwłaszcza podczas przenoszenia pożywki.  Unikaj wciągania cieczy do zatyczki pipety. Jeśli zatyczka zostanie przypadkowo zwilżona, natychmiast wymień filtr wspomagający pipetę.
• Unikaj dotykania pipety serologicznej poprzez jej częściowe rozpakowanie, dopasowanie końca do filtra wspomagającego pipetę, a następnie usunięcie papierowej tulei.
• Aby uniknąć generowania zanieczyszczających aerozoli, nie twórz pęcherzyków powietrza w pożywce lub pipecie.
  

Dezynfekcja.

Metody przeznaczone do dezynfekcji/dekontaminacji odpadów hodowlanych, powierzchni roboczych i sprzętu muszą nie tylko minimalizować ryzyko skażenia, ale także być bezpieczne dla personelu laboratorium. Podczas stosowania skoncentrowanych form środków dezynfekujących należy zawsze nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, takie jak rękawice i ochrona oczu. Wybrane rękawice powinny chronić przed przenoszoną substancją. Tabele producentów pomogą określić najlepsze rękawice do danego zadania. Główne środki dezynfekujące dzielą się na grupy, a ich względne zalety można podsumować w następujący sposób:

Podchloryn sodu lub wybielacz

• Dobry środek dezynfekujący ogólnego przeznaczenia
• Działa przeciwko wirusom
• Żrący w stosunku do metali - nie powinien być stosowany na powierzchniach metalowych, takich jak wirówki
• Łatwo dezaktywowany przez materię organiczną i dlatego powinien być często odświeżany
• Użyj komercyjnego wybielacza do stworzenia 10% (v/v) roztworu w cieczy odpadowej lub do dezynfekcji powierzchni

Alkohol (np. etanol, izopropanol).etanol, izopropanol)

• Skuteczne stężenia: 70% dla etanolu, 60-70% dla izopropanolu
• Skuteczny przeciwko bakteriom. Etanol jest skuteczny przeciwko większości wirusów, ale nie przeciwko wirusom bezotoczkowym
• Izopropanol nie jest skuteczny przeciwko wirusom
• Aldehydy są drażniące, a ich stosowanie powinno być ograniczone

Należy unikać środków dezynfekujących na bazie fenoli, ponieważ nie są one wspierane w ramach programu przeglądu dyrektywy UE w sprawie produktów biobójczych.

Jak przeprowadzić rutynowe monitorowanie zdrowych komórek

Monitorowanie kultur komórkowych jest ważną częścią codziennej hodowli komórek. Ten samouczek pomoże wyjaśnić podstawy monitorowania komórek, w tym jak wygląda zdrowa hodowla, konfluencja komórek i różne fazy wzrostu hodowli komórkowej. Ten film pokaże również typowe wskaźniki zanieczyszczenia bakteriami i mykoplazmą.

Powiązane produkty

Podłoża hodowlane	Fetal Bovine Serum	Mycoplasma Detection	Pipette Tips	Flaszki do hodowli
Trypsyna	Antybiotyki	Barwnik Hoechst	Alkohol etylowy	Pipetory
.Sterylna filtracja	.Uwierzytelnione linie komórkowe	Alkohol izopropylowy

Referencje

1. 2009. Identity crisis. Nature. 457(7232):935-936. https://doi.org/10.1038/457935b

2. Neimark J. 2015. Line of attack. Science. 347(6225):938-940. https://doi.org/10.1126/science.347.6225.938

3. Weiss RA. 1978. Why cell biologists should be aware of genetically transmitted viruses. Natl Cancer Inst Monogr. 48183-9.

4. Fogh J, Holmgren NB, Ludovici PP. 1971. A review of cell culture contaminations. In Vitro. 7(1):26-41. https://doi.org/10.1007/bf02619002

5. Merten O. 2002. 39(2):91-116. https://doi.org/10.1023/a:1022969101804

6. Freshney RI. Culture of Animal Cells. https://doi.org/10.1002/9780471747598

7. Fundamental Techniques in Cell Culture, Laboratory Handbook. [Internet]. Public Health England: Available from: https://www.phe-culturecollections.org.uk/media/101902/ecacc_lab_handbook.pdf

8. Emmett Barkley W. 1979. [4] Safety considerations in the cell culture laboratory.36-43. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(79)58125-7

9. Ryu AH, Eckalbar WL, Kreimer A, Yosef N, Ahituv N. 2017. Use antibiotics in cell culture with caution: genome-wide identification of antibiotic-induced changes in gene expression and regulation. Sci Rep. 7(1): https://doi.org/10.1038/s41598-017-07757-w