Ulepszanie chromatografii w trybie HILIC poprzez wybór odpowiedniego rozpuszczalnika do wstrzykiwania i płukania
Wprowadzenie do chromatografii HILIC
Chromatografia HILIC, znana również jako Aqueous Normal Phase (ANP), wykorzystuje polarną fazę stacjonarną, taką jak goła krzemionka, cyjano, amino, fenyl, pentafluorofenyl (PFPP) lub diol oraz stosunkowo niepolarną fazę ruchomą. Faza ruchoma zazwyczaj składa się z wysokiego procentu organicznego z wodą i buforem jako modyfikatorem. Typowymi analitami analizowanymi w tym trybie są aminy zasadowe (polarne i niepolarne), kwasy polarne i polarne substancje obojętne. HILIC jest formą podziału, woda w fazie ruchomej jest preferencyjnie adsorbowana na polarnej fazie stacjonarnej, w wyniku czego powstaje warstwa rozpuszczalnika wzbogacona w wodę w pobliżu powierzchni i warstwa rozpuszczalnika wzbogacona w substancje organiczne w fazie ruchomej. Analit jest rozprowadzany pomiędzy tymi dwiema warstwami. Bardziej polarna substancja rozpuszczona ulegnie podziałowi na warstwę wodną, a tym samym zostanie zatrzymana dłużej niż mniej polarna substancja rozpuszczona. HILIC może również obejmować wiązanie wodorowe i wymianę jonową bezpośrednio z powierzchnią.
HILIC zyskuje na popularności w ostatnich latach ze względu na zwiększoną retencję związków polarnych i alternatywną selektywność chromatografii HILIC w stosunku do fazy odwróconej. Ponadto, tryb HILIC jest wysoce kompatybilny z detekcją spektrometryczną (MS) i ewaporacyjnym rozpraszaniem światła (ELSD) ze względu na lotność fazy ruchomej. Co więcej, HILIC jest korzystny do stosowania w chromatografii preparatywnej ze względu na względną łatwość odzyskiwania związków z lotnej fazy ruchomej. Ze względu na niższą lepkość fazy ruchomej możliwe są również wyższe prędkości przepływu. Jeśli chodzi o przygotowanie próbki, eluenty o wysokiej zawartości organicznej ekstrakcji do fazy stałej (SPE) mogą być bezpośrednio wstrzykiwane do HPLC bez dalszego odparowywania i ponownej konstytucji. Wreszcie, HILIC jest przydatny w separacji metabolitów. Gdy związki są metabolizowane, stają się bardziej polarne i retencja przez fazę odwróconą jest trudna. HILIC zatrzyma te polarne związki dłużej, pozwalając na łatwiejszą separację i identyfikację tych metabolitów.
Ponieważ chromatografia HILIC może być uważana za odwróconą fazę odwróconą, istnieje szereg szczegółów operacyjnych, których analityk musi być świadomy podczas poprzedzania tej formy chromatografii. W niniejszej pracy opisano, w jaki sposób rozpuszczalnik do płukania igły autosamplera może niekorzystnie wpływać na chromatografię.
Dyskusja
Rysunek 1 przedstawia typowy chromatogram QA, który można uzyskać za pomocą kolumny Ascentis Express HILIC HPLC.Rysunek 2 to chromatogram uzyskany z nowej, nieużywanej kolumny Ascentis Express HILIC w systemie Waters® Acquity® UPLC. Należy zauważyć różnicę w stosunku do wyników uzyskanych na Rysunku 1. Podjęto kilka prób rozwiązania problemu, takich jak płukanie silnym rozpuszczalnikiem (wodą), sprawdzenie frytki końcowej, uruchomienie w innym systemie, odwrócenie kierunku przepływu, zmiana rozpuszczalników do wstrzykiwania próbek i uruchomienie kolumny o większej średnicy (4,6 mm I.D.). Żadna z tych zmian nie rozwiązała problemu.
Warunki dla rysunków 1-3 (53930-U)
Rysunek 1.Typowy chromatogram QA dla kolumny Ascentis Express HILIC
Rysunek 2.Chromatogram z pierwszego wstrzyknięcia na nowej kolumnie (niewłaściwa technika)
Podczas rozwiązywania problemów związanych ze słabą chromatografią, przegląd literatury producenta wykazał, że urządzenie ma kilka trybów wtrysku. Tryb częściowej pętli został użyty do wygenerowania chromatogramu na Rysunku 2, ponieważ była to domyślna metoda ustawiona w urządzeniu. W tym trybie częściowej pętli podano w literaturze producenta, że jest to jedyny tryb, który wstrzykuje próbkę i słaby rozpuszczalnik płuczący na kolumnę.1 Normalnie byłby to akceptowalny tryb wstrzykiwania próbek, gdyby tryb był LC z odwróconymi fazami. Jednak w trybie HILIC polaryzacje rozpuszczalnika i próbki są przeciwne w porównaniu z trybem fazy odwróconej.
Urządzenie Acquity UPLC ma dwa rozpuszczalniki płuczące, silny i słaby. Kiedy urządzenie zostało początkowo zainstalowane, silny rozpuszczalnik płuczący wynosił 10:90 woda:acetonitryl, a słaby rozpuszczalnik płuczący wynosił 90:10 woda:acetonitryl. Urządzenie wstrzykiwało niewielką objętość słabego rozpuszczalnika płuczącego (90:10 woda:acetonitryl) wraz z próbką. Ten słaby rozpuszczalnik płuczący jest w rzeczywistości silnym rozpuszczalnikiem płuczącym w trybie HILIC.
Aby ustalić, czy ten rozpuszczalnik płuczący powodował słabą chromatografię, odwrócono butelki z rozpuszczalnikiem płuczącym. Po zmianie mocy rozpuszczalnika w płuczce igłowej i wykonaniu kolejnego wstrzyknięcia uzyskano chromatogram na Rysunku 3 wskazujący, że polarność rozpuszczalnika płuczki igłowej była przyczyną słabej chromatografii.
Rysunek 3.Chromatogram po przełączeniu butelek z rozpuszczalnikiem do płukania między słabymi i mocnymi rozpuszczalnikami
Aby ustalić, czy rozwiązało to problem słabej chromatografii, butelki z rozpuszczalnikiem do płukania igieł zostały przełączone z powrotem do ich początkowej konfiguracji. Uzyskany chromatogram był podobny do pokazanego na Rysunku 2, co wskazuje, że słaba chromatografia mogła zostać odtworzona. Oprócz silnej i słabej polarności rozpuszczalnika płuczącego, zbadano inne tryby wtrysku w UPLC. Wyniki zmiennych trybów wtrysku wykazały chromatografię podobną do tej widocznej na Rysunku 3, nawet przy użyciu oryginalnego układu rozpuszczalnika płuczącego.
Wykazano, że polarność płucząca igły rozpuszczalnika odgrywa istotną rolę w chromatografii HILIC. Ponadto, tryb wtrysku również odegrał rolę w uzyskaniu dobrej chromatografii. W prezentowanej pracy początkowo podejrzewano, że kolumna jest zła. Dalsze badania wykazały, że rozpuszczalniki do płukania igieł są krytyczne w trybie HILIC, a także tryb wtrysku próbki w celu uzyskania dobrej chromatografii w tym alternatywnym trybie chromatograficznym.
Przy stosowaniu chromatografii HILIC, zwłaszcza po uruchomieniu LC w trybie fazy odwróconej, ważne jest, aby pamiętać o sprawdzeniu LC, aby upewnić się, że rozpuszczalniki do płukania igieł, typ wtrysku próbki i rozpuszczalniki próbki są kompatybilne z trybem HILIC, aby uniknąć błędów w żywotności kolumny.
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?