Czynniki wpływające na rozdzielczość w HPLC

Czytaj więcej

• Jak działa HPLC
• Rozdzielczość HPLC
• Równanie rozdzielczości
• Void Volume
• Retention Factor k
• Współczynnik selektywności lub separacji α (alfa)
• Wydajność kolumny lub liczba kolumnyWydajność kolumny lub liczba płytek teoretycznych N
• Przyczyny zmniejszonej wydajności kolumny
• Symetria szczytu
• Symetria kolumny, współczynnik asymetrii lub współczynnik ogonowy
• Współczynnik asymetrii As
• USP Tailing Factor T
• Jak poprawić rozdzielczość w HPLC

Jak działa HPLC

Proces separacji HPLC rozpoczyna się, gdy próbka jest wprowadzana do kolumny wypełnionej porowatymi cząstkami. Próbka jest wstrzykiwana i transportowana przez kolumnę przez poruszającą się fazę ciekłą (fazę ruchomą). Gdy anality napotykają fazę stacjonarną, oddziałują z nią w różnym stopniu i rozdzielają się na czyste strefy, które mogą być analizowane lub zbierane. Anality, które mają silne powinowactwo do fazy stacjonarnej, pozostaną na kolumnie dłużej.

Rozdzielczość HPLC R_s

Rozdzielczość jest ważnym wskaźnikiem wydajności HPLC, zwykle ocenianym na podstawie tego, jak szybko i jak całkowicie składniki docelowe w próbce oddzielają się podczas przechodzenia przez kolumnę. Rozdzielczość mierzy się dzieląc różnicę czasów retencji pików przez średnią szerokość piku. Rozdzielczość można również wyrazić w równaniu rozdzielczości jako kombinację czynników (separacja, wydajność i retencja), które wpływają na tę wartość.

Objętość pustej przestrzeni

W prawie wszystkich trybach HPLC do rozdzielczości kolumny wymagana jest pewna forma selektywnej retencji przez fazę stacjonarną. Aby wiedzieć, czy związek jest zatrzymywany, należy obliczyć objętość pustej przestrzeni kolumny, V₀, mierząc czas retencji dla niezatrzymywanej substancji rozpuszczonej przy danym natężeniu przepływu.

Gdy znana jest objętość pustej przestrzeni kolumny lub czas pustej przestrzeni dla danego natężenia przepływu, nie ulegnie ona zmianie. Jeśli substancja rozpuszczona eluuje w pobliżu lub w pustej przestrzeni, rozdzielczość spowodowana interakcją fazy stacjonarnej nie może wystąpić.

Rysunek 2. Równanie rozdzielczości

Współczynnik retencji k

Współczynnik retencji jest czasami określany również jako współczynnik pojemności. Jest to względny współczynnik retencji, który określa retencję w wielokrotności czasu, w którym eluuje niezatrzymany pik, t₀ lub t_M.

W równaniu rozdzielczości, t_R jest czasem retencji analitu, a t₀ jest czasem pustki (czasami t_M). Współczynnik retencji jest liczbą bezjednostkową.

Wartość k dla niezatrzymanego piku wynosi 0. Wartość k dla piku, który spędza równy czas w fazie stacjonarnej i fazie ruchomej wynosi 1. Wszystkie substancje rozpuszczone spędzają taką samą ilość czasu w fazie ruchomej i różną ilość czasu w fazie stacjonarnej. Objętość pustej kolumny w trybie fazy odwróconej jest zwykle ustalana przez wstrzyknięcie bardzo polarnego związku, takiego jak uracyl lub tiomocznik.

Większość podręczników zaleca, aby wszystkie interesujące piki były zatrzymywane z k równym 1 lub większym w celu wiarygodnego oznaczenia ilościowego. K od 2 do 3 jest pożądane, jeśli można je osiągnąć. K większe niż 10 w niewielkim stopniu poprawia rozdzielczość i wydłuża czas analizy oraz rozcieńcza próbkę, utrudniając jej wykrycie.

Rysunek 3. Współczynnik retencji k

Współczynnik selektywności lub separacji α (alfa)

Gdy v_M lub t_M przy danym natężeniu przepływu dla danej kolumny, nie ulegnie on zmianie. Selektywność lub współczynnik separacji α (alfa) jest obliczany na podstawie stosunku wartości k dla sąsiednich pików. Wartość k dla późniejszego piku jest zawsze umieszczana w liczniku, dzięki czemu wartości k są zawsze równe lub większe niż 1.

Dobra selektywność dla HPLC wynosi 1,1, co pozwala osiągnąć rozdzielczość 1,5 przy około 10 000 teoretycznych miejsc. Para krytyczna w separacji jest definiowana jako sąsiednie substancje rozpuszczone, które mają najmniejszą wartość α. Para krytyczna definiuje minimalną liczbę płytek potrzebnych do osiągnięcia określonej rozdzielczości, co z kolei określa minimalny rozmiar cząstek i długość kolumny.  

Wydajność kolumny lub liczba teoretycznych płytek N

Wydajność kolumny, szybkość rozprzestrzeniania się strefy mierzona poprzez stosunek czasu retencji do szerokości piku i podniesienie go do kwadratu, jest zwykle wyrażana jako N. Gdy szerokość piku jest mierzona w połowie wysokości, stała wynosi 5,54. Jeśli szerokość piku jest mierzona u podstawy, należy użyć stałej 16, aby uzyskać mniej więcej taką samą wartość N.

Czas retencji i szerokość piku muszą być mierzone w tych samych jednostkach, aby można było prawidłowo określić wydajność kolumny.

Przyczyny zmniejszonej wydajności kolumny

• Przepływ laminarny lub opór spowodowany przez ściankę rurki może powodować poszerzenie pasma poza złożem kolumny. Zbyt dużo rurek łączących lub rurki o zbyt dużej średnicy mogą znacznie zmniejszyć obserwowaną rozdzielczość.
• Efekty komory mieszania. Otwarta rurka staje się doskonałym mieszalnikiem, jeśli próbka spędza zbyt dużo czasu w tym środowisku. Ma to niepożądany wpływ na zmniejszenie N i obniżenie rozdzielczości. Efekt ten można zminimalizować, wykonując połączenia za pomocą bardzo krótkich odcinków rurek o małej średnicy wewnętrznej (I.D.). W przypadku kolumn o małej średnicy wewnętrznej należy zachować większą ostrożność. Dyspersja pozakolumnowa jest często obszarem, w którym dwa systemy HPLC różnią się od siebie. Jeden system zwykle wykazuje wyższą wydajność przy tej samej kolumnie, ponieważ ma bardziej wydajną (krótszą / węższą) ścieżkę przepływu od wtryskiwacza przez kolumnę do detektora.
• Prądy wzdymające, które mogą powodować ostre zakręty, zmiany średnicy wewnętrznej oraz nieregularności lub zadziory na ścieżce przepływu mogą przyczynić się do zmniejszenia wydajności kolumny.

Symetria piku

Symetria piku również wpływa na wydajność kolumny, a tym samym na rozdzielczość. Silnie absorbujące lub aktywne miejsca są często odpowiedzialne za piki ogonowe. Kolumny mogą wykazywać wysoką wydajność i rozdzielczość dla neutralnych substancji rozpuszczonych oraz bardzo niską wydajność i rozdzielczość dla zasad lub kwasów, jeśli takie aktywne miejsca są obecne.

Solute tailing jest zgłaszany jako poszerzenie piku z wydłużoną prawą połową piku. Nadmierna aktywność kolumny dla substancji rozpuszczonej niekoniecznie jest cechą charakterystyczną starszej kolumny, która utraciła fazę stacjonarną. Można go również zaobserwować w nowych kolumnach, w których skład chemiczny fazy nie został zoptymalizowany dla danego typu próbki i warunków pracy.

Symetria kolumny, współczynnik asymetrii lub współczynnik ogonowania

Współczynnik asymetrii A_s

Międzynarodowa organizacja normalizacyjna ASTM zaleca obliczanie symetrii lub asymetrii kolumny (A_s) jako stosunku tyłu do przodu dwusiecznej piku mierzonego na 10% wysokości.

USP tailing factor T

Pik ogonowy ma front większy niż 1,0, podczas gdy pik czołowy ma front mniejszy niż 1,0. Farmakopea Amerykańska (USP) zaleca również mierzenie współczynnika ogonowania (T) jako stosunku tyłu do przodu dwusiecznej piku mierzonego na 5% wysokości. Stosunek ten oblicza się dzieląc całkowitą szerokość przez dwukrotność szerokości przedniej.

Symetria a współczynnik ogonowania USP

Obydwie metody obliczeniowe dają tę samą wartość 1 dla symetrycznego piku, ale metoda USP daje mniejsze wartości dla ogonowania i frontingu niż metoda ASTM. W przypadku korzystania z automatycznej metody obliczania symetrii należy sprawdzić system danych, aby zobaczyć, która metoda jest używana. Wiele systemów danych udostępnia obie metody obliczeń.

Jak poprawić rozdzielczość w HPLC

Zwiększ N (wydajność) poprzez:

• Zwiększenie długości kolumny
• Zmniejszenie wielkości cząstek
• Zmniejszenie ogonowania piku
• Zwiększenie temperatury
• Zmniejszenie dodatkowej objętości kolumny

Zmiana α (selektywności) poprzez:

• Zmianę fazy stacjonarnej kolumny
• Zmianę pH fazy ruchomej
• Zmianę rozpuszczalnika(ów) fazy ruchomej

Zwiększenie k (retencji) przez:

• Użycie słabszego rozpuszczalnika (zmiana polarności)
• Zmianę jonizacji (polarności) analitu poprzez zmianę pH
• Użycie silniejszej fazy stacjonarnej (zmiana polarności)

Uwagi dotyczące rozdzielczości:

• Gdy próbka zawiera wiele pików, analiza jest zwykle wykonywana dla pary krytycznej.
• Wszystkie analizowane piki muszą zostać zachowane, aby kolumna w ogóle działała. Praca w pobliżu frontu rozpuszczalnika zwiększa ryzyko wystąpienia koelucji.

Wiele informacji przedstawionych na tej stronie zostało pierwotnie przedstawionych w serii webinariów  Podstawy kolumn HPLC przez dr. Richarda A. Henry'ego, emerytowanego profesora chemii analitycznej Pennsylvania State University i wybitnego znawcy technologii separacji.