Test enzymatyczny deoksyrybonukleazy I (EC 3.1.21.1)
1. Cel
Standaryzacja procedury oznaczania enzymatycznego deoksyrybonukleazy I.
2. Zakres
Niniejsza procedura ma zastosowanie do wszystkich produktów, które mają specyfikację dla aktywności deoksyrybonukleazy I.
3. Definicje
3.1. Woda oczyszczona - woda z systemu dejonizacyjnego, rezystywność > lub = 18MΩ-cm @ 25 ºC
3.2. Definicja jednostki - Jedna jednostka Kunitza wytworzy ΔA260 0,001 na minutę na ml przy pH 5,0 w temperaturze 25 °C, używając DNA typu I lub III jako substratu.
3.3. DNA - kwas dezoksyrybonukleinowy
4. Dyskusja
DNA + H2O Deoksyrybonukleaza I > 5- Oligodeoksyrybonukleotydy
Nie ma absolutnego standardu do oznaczania deoksyrybonukleazy. Gdy stosowana jest procedura Kunitza, na wynik ma wpływ konkretna partia substratu, która jest używana. Do badań DNazy Sigma-Aldrich oferuje standaryzowaną fiolkę (D4263), która została znormalizowana tak, aby zawierała 2000 jednostek Kunitza przy użyciu naszego DNA (D3664) jako substratu.
5. Obowiązki
Wszyscy przeszkoleni pracownicy laboratorium Analytical Services są odpowiedzialni za przestrzeganie niniejszego protokołu zgodnie z jego zapisami.
6. Bezpieczeństwo
W celu zapoznania się z zagrożeniami i odpowiednimi środkami ostrożności należy zapoznać się z kartą charakterystyki substancji niebezpiecznej (SDS). Deoksyrybonukleaza I jest substancją uczulającą, należy zachować odpowiednią ostrożność, aby zminimalizować narażenie.
7. Procedura
7.1. WARUNKI: T = 25 ºC, pH = 5,0, A260nm, ścieżka światła = 1 cm
7.2. METODA: Ciągłe spektrofotometryczne oznaczanie szybkości
7.3. ODCZYNNIKI:
7.3.1. 1,0 M bufor octanu sodu, pH 5.0 w 25 ºC (Bufor) Przygotuj roztwór 136 mg/ml w wodzie oczyszczonej przy użyciu octanu sodu, trihydratu (S8625). Dostosuj do pH 5.0 w 25 ° C za pomocą 5 M HCl.
7.3.2. 100mM roztwór siarczanu magnezu (MgSO4) Przygotuj roztwór 12 mg/mL w wodzie oczyszczonej używając siarczanu magnezu, Heptahydrate (M1880).
7.3.3. 0,033% (w/v) Roztwór kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA)
7.3.3.1.Przygotować w oczyszczonej wodzie przy użyciu kwasu dezoksyrybonukleinowego (D3664).
7.3.3.2. Rozpuścić w stężeniu 0,33 mg DNA/ml. Pozostawić roztwór na lodzie na co najmniej 30 minut, a następnie mieszać przez powolne odwracanie aż do całkowitego rozpuszczenia.
7.3.3.3. Jeśli używanych jest wiele fiolek D3664, przygotuj każdą z nich osobno, a następnie połącz zawartość przed kontynuowaniem kroku 7 procedury testu.4.1.
7.3.4. 0,85% chlorek sodu (NaCl)
Użyj roztworu chlorku sodu, 0,85%, (S0817).
7.3.5. Standardowy roztwór DNazy (Std Soln)
7.3.5.1.Odtworzyć fiolkę deoksyrybonukleazy I, fiolkę standaryzowaną, zawierającą 2000 jednostek Kunitza (D4263), z 1 ml zimnego odczynnika 7.3.4 (NaCl).
7.3.5.2. Bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć do 400-500 nieskorygowanych jednostek Kunitza/mL zimnym Odczynnikiem 7.3.4 (NaCl). Nieskorygowane jednostki/ml odpowiadają ΔA260 nm/min 0,067 - 0,083.
7.3.6. Roztwór enzymu deoksyrybonukleazy I (test)
7.3.6.1.Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór zawierający 400 - 500 jednostek Kunitza/ml w zimnym odczynniku 7.3.4 (NaCl).
7.3.6.2. Próbki do badania zanieczyszczeń powinny być pobierane w stężeniu 10 mg/ml, chyba że określono inaczej.
7.4. PROCEDURA ANALIZY
7.4.1. Określić stężenie DNA w Odczynniku 7.3.3 w następujący sposób:
7.4.1.1. Odmierzyć pipetą następujące stężenia (w mililitrach) do odpowiednich kuwet kwarcowych (wykonać w dwóch egzemplarzach):
7.4.1.2. Zapisać absorbancję każdego testu przy 260 nm. Jest to próba ślepa. Następnie dodaj następujące składniki do każdej kuwety:
7.4.1.3. Zapisz absorbancję każdego testu przy 260 nm. To jest Test.
7.4.1.4. Obliczyć stężenie DNA według następującego wzoru:
| mg DNA/mL = | (A260nm Test - A260nm Blank) X 3.0 |
| 20 X 0.1 |
20 = E0,1% DNA. Jedna jednostka A260nm odpowiada 50 mikrogramom DNA. 3,0 = końcowa objętość roztworu testowego
7.4.2. Przygotuj koktajl reakcyjny, pipetując następujące składniki (w mililitrach) do odpowiedniego pojemnika:
*Uwaga: Ilości DNA i wody w koktajlu reakcyjnym można dostosować w razie potrzeby ze względu na stężenie odczynnika 7.3.3. Końcowe stężenie DNA w koktajlu reakcyjnym powinno wynosić 0,004% (w/v) lub 0,04 mg/ml.
7.4.3. Delikatnie wymieszaj przez wirowanie, a następnie dostosuj pH tego roztworu do 5.0 w temperaturze 25 ° C za pomocą 0,1 N HCl lub NaOH, w razie potrzeby.
7.4.4. Odpipetuj następujące ilości (w mililitrach) do odpowiednich kuwet kwarcowych:
7.4.5. Wyrównać w temperaturze 25 °C w odpowiednio termostatowanym spektrofotometrze przez około 5 minut, a następnie dodać:
7.4.5.1 Jeśli prowadzone są różne poziomy enzymu, całkowita objętość reakcji musi być dostosowana do 3,00 ml przy użyciu odczynnika 7.3.4. (NaCl).
7.4.5.2 Najszybsze tempo jest zwykle w pierwszych 1-2 minutach reakcji. Dlatego zaleca się przeprowadzanie tylko jednej lub dwóch reakcji na raz.
7.4.6. Natychmiast wymieszać przez odwrócenie i rejestrować wzrost A260nm przez około 3-5 minut. Uzyskaj ΔA260nm/minutę, używając maksymalnej szybkości liniowej dla ślepej próby, wzorców i testów.
7.5. OBLICZENIA
7.5.1.
| Units/ Std Vial = | (ΔA260nm/min Std - ΔA260nm/min Blank) X (3) X (df) |
| (0.001) X (0.5) |
7.5.2
| Współczynnik korygujący = | Wartość uwalniania fiolki Std(Units/vial) |
| Wartości eksperymentalne/fiolka Std |
7.5.3.
| Units/ mg solid = | (ΔA260nm/min Test- ΔA260nm/min Blank) X (3) X (df) X (CF) |
| (0.001) X (0.5) |
3 = objętość (mililitry) testu
0,5 = objętość enzymu użytego w każdym teście
df = współczynnik rozcieńczenia
0,001 = ΔA260nm zgodnie z definicją jednostki
CF = współczynnik korygujący
7.6. KOŃCOWE STĘŻENIE ANALIZY
W mieszaninie reakcyjnej o objętości 3,00 ml końcowe stężenia wynoszą 83 mM octanu sodu, 4,2 mM siarczanu magnezu, 0.14% chlorku sodu, 0,003% (w/v) kwasu dezoksyrybonukleinowego i 200-250 jednostek dezoksyrybonukleazy I.
8. Referencje & Załączniki
8.1 Kunitz, M. (1950) Journal of General Physiology 33, 349-362
8.2 Kunitz, M. (1950) Journal of General Physiology 33, 363-377
8.3 Lindberg, U. (1964) Biochimica et Biophysica Acta 82, 237-248
9. Zatwierdzenie
Przegląd, zatwierdzenia i podpisy dla tego dokumentu zostaną wygenerowane elektronicznie przy użyciu DocCompliance (QUMAS). Wydrukuj kopię "Do użytku", jeśli wymagana jest kopia papierowa z weryfikacją podpisu.
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?