Test enzymatyczny β-glukuronidazy (EC 3.2.1.31) z E. coli

1. Cel

Standaryzacja procedury enzymatycznego oznaczania β-glukuronidazy.

2. Zakres

Zakres niniejszej procedury obejmuje wszystkie produkty E. coli, które mają specyfikację dla aktywności β-glukuronidazy.

3. Definicje

Jedna zmodyfikowana jednostka "Fishman" uwolni 1.0 μg fenoloftaleiny z glukuronidu fenoloftaleiny na godzinę przy pH 6,8 w temperaturze 37 °C.

4. Dyskusja

Phep-Gluc + H₂O    ^{β-glukuronidaza}   > D-glukuronian + fenoloftaleina
Stosowane skróty:
PheP-Gluc = glukuronid fenoloftaleiny

5. Obowiązki

Personel służb analitycznych powinien postępować zgodnie z niniejszym protokołem.

6. Bezpieczeństwo

W celu zapoznania się z zagrożeniami i odpowiednimi środkami ostrożności należy zapoznać się z kartą charakterystyki substancji niebezpiecznej (SDS).

7. Procedura

Warunki:

T = 37 °C, pH = 6.8, A_540nm, ścieżka światła = 1 cm

Metoda:

spektrofotometryczne oznaczanie szybkości zatrzymania

Odczynniki:

• 75 mM bufor fosforanu potasu z 1.0% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej, pH 6,8 w 37 °C
  Przygotować 100 ml w wodzie dejonizowanej przy użyciu fosforanu potasu, jednozasadowego, bezwodnego, Nr produktu. P5379 i albuminy bydlęcej, Nr produktu A4503. Dostosować do pH 6,8 w 37 °C za pomocą 1 M KOH.
• 3.0 mM roztwór substratu glukuronidu fenoloftaleiny (PheP-Gluc)
  Przygotuj 10 mL w wodzie dejonizowanej używając wolnego kwasu glukuronowego fenoloftaleiny, nr produktu P0501.
• 200 mM roztwór buforowy glicyny, pH 10,4.
  Użyj roztworu buforowego glicyny, nr produktu 105-2, lub przygotuj 100 ml w wodzie dejonizowanej, używając wolnej zasady glicyny, nr produktu G7126. Doprowadzić do pH 10,4 w temperaturze 37°C za pomocą 1 M NaOH.
• Roztwór enzymu β-glukuronidazy
  Bezpośrednio przed użyciem najpierw przygotować roztwór β-glukuronidazy o stężeniu 5 mg/ml w zimnym Odczynniku A. Następnie rozcieńczyć do końcowego stężenia. Następnie rozcieńczyć do końcowego stężenia 400 - 800 jednostek/ml w zimnym odczynniku A.
• 95% (v/v) etanol
  Przygotować 20 ml w wodzie dejonizowanej używając 200 Proof USP Ethyl Alcohol, Quantum Chemical Corporation.
• 0,05% (w/v) Roztwór wzorcowy fenoloftaleiny (Std Soln)
  Przygotuj 5 ml rozpuszczając 2,5 mg fenoloftaleiny, Produkt Nr. P9750 w 5 ml odczynnika E lub użyj roztworu wzorcowego fenoloftaleiny.

Metoda badania:

Odmierzyć pipetą (w mililitrach) następujące odczynniki do odpowiednich pojemników: 

	Test	Blank
Woda dejonizowana	0.65	0.65
Odczynnik A (Bufor)	0.50	0.50
Odczynnik B (PheP-Gluc)	0,25	0,25

Wymieszać przez odwrócenie i wyrównać do 37 °C. Następnie dodać:

Odczynnik D (roztwór enzymu)

0.10

------

Wymieszać przez odwrócenie i inkubować w temperaturze 37 °C przez dokładnie 30 minut. Następnie dodać:

Odczynnik C (Bufor glicynowy)	5.00	5.00
Odczynnik D (Roztwór enzymu)	------	0.10

Natychmiast wymieszać przez odwrócenie. Przenieś roztwory do odpowiednich kuwet i zapisz absorbancję przy 540 nm zarówno dla testu, jak i próby ślepej za pomocą odpowiedniego spektrofotometru.

Krzywa standardowa:

Przygotuj krzywą standardową, pipetując (w mililitrach) następujące odczynniki do odpowiednich pojemników:

 

	Std 1	Std 2	Std 3	Std 4	Std 5	Blank
Woda dejonizowana	0.65	0.65	0.65	0.65	0.65	0.65
Odczynnik A (Bufor)	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50
Odczynnik B (PheP-Gluc)	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25
Odczynnik F (Std Soln)	0.02	0.03	0.05	0.07	0.10	----
Odczynnik E (etanol)	0.08	0.07	0.05	0.03	----	0.10
Odczynnik C (bufor glicynowy)	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00

Wymieszać przez odwrócenie i przenieść wzorce do odpowiednich kuwet. Zapisać wartość A540nm dla każdego wzorca za pomocą odpowiedniego spektrofotometru.

Obliczenia:

Krzywa wzorcowa:
Skorygowana ΔA₅₄₀ Standard = A₅₄₀ Standard - A₅₄₀ Ślepa próba wzorcowa
Przygotuj krzywą wzorcową, wykreślając ΔA₅₄₀ dla wzorca w stosunku do mikrogramów fenoloftaleiny.

Oznaczanie próbki:
Skorygowane ΔA₅₄₀ Próbka = A₅₄₀ Próbka - A₅₄₀ Próba ślepa
Określić całkowitą liczbę mikrogramów uwolnionej fenoloftaleiny, korzystając z krzywej wzorcowej.

Jednostki/mL enzymu =	(μg uwolnionej fenoloftaleiny)(2)(df)
	(0.1)

2 = Korekta czasowa testu (definicja jednostki = 1 godzina)
df = Współczynnik rozcieńczenia
0,1 = Objętość (w mililitrach) użytego enzymu

Units/g solid =	units/mL enzyme
	g solid/mL enzyme

.

Jednostki/g białka =	jednostki/mL enzymu
	g białka/mL enzymu

.

Końcowe stężenie testu:

W mieszaninie reakcyjnej o objętości 1,50 ml końcowe stężenia wynoszą 30 mM fosforanu potasu, 0,50 mM kwasu glukuronowego fenoloftaleiny i 40-80 jednostek β-glukuronidazy.

UWAGI:

1. Ten test jest oparty na cytowanych referencjach.
2. W przypadku, gdy nasz produkt lub są określone, można zastąpić równoważne odczynniki.