Protokół testu enzymatycznego hydroksyproliny

Wprowadzenie

Ten protokół testu jest odpowiedni do kolorymetrycznego wykrywania hydroksyproliny w supernatantach hodowli komórkowych i tkankowych, moczu, osoczu, surowicy i innych próbkach biologicznych przy użyciu zestawu Hydroxyproline Assay Kit (MAK008). Stężenie hydroksyproliny jest określane poprzez reakcję utlenionej hydroksyproliny z 4-(dimetyloamino)benzaldehydem (DMAB), w wyniku której powstaje produkt kolorymetryczny (560 nm), proporcjonalny do obecnej hydroksyproliny. Liniowy zakres wykrywania dla tego testu wynosi od 0,2 do 1,0 µg.

Read more about

• Reagents
• Instrukcje przygotowania
• Procedura
• Wyniki

Odczynniki

• Bufor utleniający (10 mL)
• Koncentrat chloraminy T (0.6 mL)
• Roztwór kwasu chlorowodorowego i izopropanolu (5 mL)
• Koncentrat DMAB w DMSO (5 mL)
• Wzorzec hydroksyproliny, 1 mg/ml (0.1 mL)

Odczynniki i sprzęt wymagane, ale niedostarczone

• 96-dołkowa płytka z płaskim dnem - zaleca się stosowanie przezroczystych płytek (nr produktu. M4436 lub równoważny) do testów kolorymetrycznych.
• Spektrofotometryczny czytnik płytek wielodołkowych
• Stężony (37% lub ~12 M) kwas solny (HCl, nr produktu 320331 lub równoważny)
• Węgiel aktywny (nr produktu. 242276 lub równoważny)
• Blok grzejny 120 °C
• Pipeta kompatybilna ze stężonym HCl
• Wyparka odśrodkowa lub piec 60 °C
• Fiolka ciśnieniowa z korkiem wyłożonym PTFE lub fiolka polipropylenowa o pojemności 2 ml.

Instrukcje przygotowania

• Krótko odwirować fiolki przed otwarciem.
• Używać ultraczystej wody do przygotowania odczynników.
• Aby zachować integralność odczynnika, unikać powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania.
• Bufor utleniający - przed użyciem pozwolić buforowi osiągnąć temperaturę pokojową.
• Koncentrat DMAB - ogrzać do temperatury pokojowej, aby stopić zamrożony roztwór tuż przed użyciem. Przechowywać chroniony przed światłem i wilgocią w temperaturze -20°C.
  

Przechowywanie / Stabilność

Zestaw jest dostarczany w mokrym lodzie. Zaleca się przechowywanie w temperaturze 2-8 °C, chroniąc przed światłem.

Procedura

Wszystkie próbki i wzorce powinny być wykonywane w duplikatach. Do przygotowania wzorców i próbek należy używać ultraczystej wody.

Wzorce hydroksyproliny do wykrywania kolorymetrycznego

Rozcieńczyć 10 µL roztworu wzorcowego hydroksyproliny o stężeniu 1 mg/ml w 90 µL wody, aby przygotować roztwór wzorcowy o stężeniu 0,1 mg/ml. Dodaj 0, 2, 4, 6, 8 i 10 µL roztworu wzorcowego hydroksyproliny o stężeniu 0,1 mg/mL do płytki z 96 dołkami, uzyskując 0 (ślepa próba), 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 i 1,0 µg/dołek wzorcowy.

Przygotowanie próbek

Aby przygotować próbki surowicy lub moczu, przenieś 100 µL próbki do szczelnej fiolki z korkiem wyłożonym PTFE lub probówki polipropylenowej o pojemności 2,0 ml. Dodać 100 µl stężonego kwasu solnego (HCl, ~12 M), szczelnie zamknąć i hydrolizować w temperaturze 120 °C przez 3 godziny. Dodać 5 mg węgla aktywowanego, wymieszać i odwirować z prędkością 13 000 x g przez 2 minuty. Przenieść 10-50 µL supernatantu na płytkę 96-dołkową.

Homogenizować 10 mg tkanki lub komórek w 100 µL wody i przenieść do szczelnej fiolki z korkiem wyłożonym PTFE lub probówki polipropylenowej o pojemności 2,0 ml. Dodać 100 µl stężonego kwasu solnego (HCl, ~12 M), szczelnie zamknąć i hydrolizować w temperaturze 120 °C przez 3 godziny. Przenieść 10-50 µl supernatantu na 96-dołkową płytkę.

Odparować wszystkie studzienki (próbki i wzorce) do sucha pod próżnią. W przypadku nieznanych próbek zaleca się przetestowanie kilku rozcieńczeń próbki, aby upewnić się, że odczyty mieszczą się w zakresie liniowym krzywej wzorcowej.

Reakcja testowa

Przygotowanie odczynników testowych - następujące 2 odczynniki testowe są stabilne przez 2-3 godziny po przygotowaniu i powinny być przygotowane po przygotowaniu próbki, tuż przed rozpoczęciem testu.

Chloramina T/mieszanina buforu utleniającego - 100 µL jest wymagane dla każdego dołka reakcyjnego. Dla każdej studzienki dodać 6 µL koncentratu chloraminy T do 94 µL buforu utleniającego i dobrze wymieszać.

Rozcieńczony odczynnik DMAB - 100 µL jest wymagane dla każdej studzienki reakcyjnej. Dla każdego dołka dodaj 50 µL koncentratu DMAB do 50 µL roztworu kwasu nadchlorowego/izopropanolu i dobrze wymieszaj.

1. Dodaj 100 µL mieszaniny chloraminy T/buforu utleniającego do każdego dołka z próbką i wzorcem. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
2. Dodać 100 µL rozcieńczonego odczynnika DMAB do każdej studzienki z próbką i wzorcem i inkubować przez 90 minut w temperaturze 60°C.
3. Pomierzyć absorbancję przy 560 nm (A₅₆₀).

Wyniki

Obliczenia

Tłem dla testu jest wartość uzyskana dla 0 (ślepej próby) wzorca hydroksyproliny. Skoryguj tło, odejmując wartość ślepej próby od wszystkich odczytów. Wartości tła mogą być znaczące i należy je odjąć od wszystkich odczytów.

Użyj wartości uzyskanych z odpowiednich wzorców hydroksyproliny do wykreślenia krzywej wzorcowej. Ilość hydroksyproliny obecnej w próbkach można określić na podstawie krzywej standardowej.

Uwaga: Nowa krzywa standardowa musi być ustawiona za każdym razem, gdy test jest uruchamiany.

Stężenie hydroksyproliny

Sa/Sv = C
Sa = Ilość hydroksyproliny w nieznanej próbce (µg) z krzywej wzorcowej
Sv = Objętość próbki (µg) z krzywej wzorcowej. Sv = objętość próbki (µL) dodana do studzienek
C = stężenie hydroksyproliny w próbce

Obliczanie próbki

Ilość hydroksyproliny (Sa) = 5.84 µg
Objętość próbki (Sv) = 50 µL

Stężenie hydroksyproliny w próbce
5,84 µg/50 µL = 0,1168 µg/µL