Sterylizacja eksplantów - protokół hodowli tkanek roślinnych

Sterylizacja powierzchniowa materiału roślinnego jest ważnym krokiem podczas ustanawiania protokołu hodowli tkanek roślinnych. Powszechnie stosowane środki dezynfekujące do hodowli tkanek roślinnych oraz metody dezynfekcji zielonych kapsułek, suchych nasion i dezynfekcji nasion orchidei są wyszczególnione poniżej.

Powszechnie stosowane środki dezynfekujące do hodowli tkanek roślinnych

Środek dezynfekujący	Nr produktu	Stężenie (%)	Ekspozycja (min.)
Stężenie (%)	Ekspozycja (min)
Podchloryn wapnia	211389.	9-10	5-30
Podchloryn sodu*	425044	0.5-5	5-30
Nadtlenek wodoru	H1009	3-12	5-15
Alkohol etylowy	E7148	70-95	0.1-5.0
azotan srebra	S7276	1	5-30
Chlorek merkurowy	M1136	0.1-1.0	2-10
Chlorek benzalkoniowy	B1383	0.01-0.1	5-20

*Handlowy wybielacz zawiera około 5% podchlorynu sodu, a zatem może być stosowany w stężeniu 10-20%, co odpowiada 0,5-1,0% podchlorynu sodu.

Procedury sterylizacji mogą być wzmocnione przez następujące działania:

• Umieszczenie materiału w 70% roztworze alkoholu etylowego przed obróbką innym roztworem dezynfekującym. Zastosowanie dwuetapowej (dwuźródłowej) procedury sterylizacji okazało się korzystne w przypadku niektórych gatunków.
• Użycie środka zwilżającego, takiego jak TWEEN^® 20 lub 80 (numery produktów. P1379 lub P1754, odpowiednio), można dodać do środków dezynfekujących w celu zmniejszenia napięcia powierzchniowego i umożliwienia lepszego kontaktu z powierzchnią.
• Przeprowadzanie procesu sterylizacji pod próżnią. Powoduje to usunięcie pęcherzyków powietrza i zapewnia bardziej wydajny proces sterylizacji.

Sterylizacja nasion orchidei

Nasiona orchidei są bardzo małe i zawierają niewiele lub nie zawierają żadnych rezerw pokarmowych. Pojedyncza kapsułka nasienna może zawierać od 1 500 do 3 000 000 nasion. Wysiew nasion in vitro umożliwia kiełkowanie niedojrzałych nasion (zielonych strąków). Sterylizacja zielonych kapsułek jest znacznie łatwiejsza niż pojedynczych nasion po rozłupaniu kapsułki. Lucke (1971) wskazał, że nasiona orchidei mogą być sterylizowane, gdy kapsułka jest dojrzała w około dwóch trzecich. Poniżej znajdują się szacowane normalne czasy dojrzewania kapsułek dla różnych gatunków storczyków.

Rodzaje storczyków	Czas do osiągnięcia dojrzałości (miesiące)
Bulbophyllum	3
Calanthe	4
Cattleya	11
Coelogyne	13
Cymbidium	10
Cypripedum	3.5
Dendrobium	12
Epidendrum	3.5
Laelia	9
Masdevallia	3.5
Miltonia	9
Odontoglossum	7
Paphiopedilum	10
Phalaenopsis	6
Stanhopea	7
Vanda	20

Sterylizacja zielonych kapsułek

1. Zanurz kapsułkę w 100% roztworze wybielacza na 30 minut.
2. Zanurz kapsułkę w 95% alkoholu i podpal.
3. W warunkach aseptycznych otwórz kapsułkę i zeskrob nasiona.
4. Ostrożnie ułóż nasiona na powierzchni pożywki.

Sterylizacja suchych nasion

1. Zbierz nasiona i umieść je w małej kolbie lub butelce, lub umieść w skróconej pipecie, której jeden koniec jest uszczelniony bawełną. Uszczelnij drugi koniec pipety bawełną, gdy nasiona zostaną umieszczone w pipecie.
2. Przygotuj roztwór zawierający 5-10% komercyjnego wybielacza zawierającego kilka kropli TWEEN^® 20.
3. Dodaj roztwór wybielacza do kolby lub zassij roztwór do pipety. Wiruj kolbą zawierającą nasiona i wybielacz lub wielokrotnie pobieraj i zasysaj roztwór wybielacza do i z pipety.
4. Sterylizuj nasiona przez 5-10 minut.
5. Usuń roztwór wybielacza i przepłucz nasiona sterylną wodą o jakości hodowli tkankowej.
6. Przenieś nasiona do sterylnego podłoża hodowlanego.