Wyciek z kolumny spektralnej w zawierających azot polarnych fazach stacjonarnych HPLC
Carmen T. Santasania, David S. Bell
Reporter EU Volume 16
Wprowadzenie
Chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas stała się jednym z najważniejszych narzędzi w laboratorium chemii analitycznej w ciągu ostatniej dekady. Uzyskiwane informacje strukturalne wraz z czułą detekcją sprawiły, że technika ta stała się niezbędna w farmacji, ochronie środowiska i wielu innych dyscyplinach naukowych.
Krwawienie z kolumny HPLC jest głównym źródłem sygnału tła w analizach LC-MS. Ten wyciek fazowy występuje, gdy faza związana eluuje z kolumny podczas analizy. Krwawienie może pochodzić z kwaśnej hydrolizy fazy związanej przy niskich wartościach pH fazy ruchomej lub z rozpuszczania substratu krzemionkowego w bardziej zasadowych warunkach. Większość producentów kolumn zaleca stosowanie kolumn opartych na krzemionce w zakresie pH od 2 do 7,5, jednak hydroliza fazy C18 może wystąpić przy użyciu faz ruchomych przy pH 2-3, a powolne rozpuszczanie substratów krzemionkowych występuje w powszechnie stosowanym zakresie pH.
W tym raporcie badamy zakres krwawienia fazy stacjonarnej dla kilku dostępnych na rynku faz polarnych zawierających azot. W badaniu wykorzystano fazę ruchomą o niskim pH w celu wywołania hydrolizy fazy związanej wraz z elucją gradientową w celu zapewnienia elucji wszelkich uwolnionych materiałów fazowych. Przed analizą każda z kolumn użytych w tym badaniu została dokładnie umyta i przechowywana w metanolu 50:50: woda przez dwa dni. Procedura ta zmniejsza prawdopodobieństwo zaobserwowania krwawienia ze źródeł innych niż spowodowane niestabilnością fazy stacjonarnej.
Doświadczalne
Analizy krwawienia przeprowadzono na systemie Waters® (Milford, MA USA) 2795 HPLC sprzężonym ze spektrometrem mas Waters Micromass ZQ za pośrednictwem interfejsu elektrorozpylania. Interfejs działał w trybie jonów dodatnich i uzyskano zakres m/z od 50 do 1500.
Acetonitryl i woda były klasy LC-MS. Kwas mrówkowy uzyskany od tego samego dostawcy był klasy HPLC. Przed każdą analizą krwawienia z kolumny uzyskano ślepą próbę bez kolumny w linii, aby ustalić reakcje spowodowane zanieczyszczeniami systemu. Następnie każdą kolumnę poddano pięciu cyklom gradientu. Warunki HPLC przedstawiono na Rysunku A.
Rysunek A.Skumulowane widma masowe dla faz stacjonarnych Ascentis™ RP-Amide i Urea Polar Embedded (565324-U)
Wyniki i dyskusja
Bogate w informacje eksperymenty LC-MS są trudne do przedstawienia w całości. Dla zwięzłości, połączone widma masowe dla każdego przebiegu uzyskano poprzez akumulację widm w zakresie czasowym 14-16 minut. To właśnie w tym przedziale czasowym obserwuje się największe stężenie reakcji masowych spowodowanych krwawieniem fazowym. Ponadto odpowiedzi spektralne w tym raporcie są prezentowane w zakresie m/z 200-600. Prezentacja danych w tym zakresie pozwala uniknąć komplikacji wynikających z obfitych odpowiedzi masowych w niskich zakresach m/z pochodzących z zanieczyszczenia systemu. Widmo masowe uzyskane przy użyciu fazy stacjonarnej Ascentis RP-Amide jest porównane z odpowiedzią fazy polarnej z mocznikiem na Rysunku A.
Widmo Ascentis RP-Amide wykazuje ograniczoną liczbę odpowiedzi masowych z powodu krwawienia kolumny w tym regionie.Tabela 1 zawiera listę znaczących odpowiedzi masowych, których nie zaobserwowano w ślepych przebiegach dla kolumny Ascentis RP-Amide i kilku dostępnych na rynku amidowych, karbaminianowych i mocznikowych faz polarnych. Faza Ascentis RP-Amide wykazuje trzy niewielkie reakcje masowe, które można przypisać upustowi fazy stacjonarnej (m/z 355, 359 i 377). Analiza z dostępnej na rynku fazy polarnej z mocznikiem wykazuje liczne intensywne reakcje masowe w badanym obszarze, co wskazuje na znaczne krwawienie. W przypadku fazy karbaminianowej reakcje masowe są znacznie mniej intensywne niż w przypadku kolumny mocznikowej; istnieją jednak dodatkowe reakcje masowe, które można przypisać krwawieniu z fazy. Zwiększa to prawdopodobieństwo interferencji analitu przez krwawienie fazowe, co może prowadzić do większych trudności w interpretacji widmowej. Druga dostępna na rynku faza amidowa wykazuje taką samą liczbę odpowiedzi masowych jak Ascentis RP-Amide, jednak występuje znaczny wzrost intensywności odpowiedzi, co skutkuje wyższym tłem.
Wnioski
W tym badaniu zbadaliśmy charakterystykę krwawienia LC-MS faz stacjonarnych zawierających azot. Wyniki pokazują, że faza Ascentis RP-Amide wykazuje mniej i mniej intensywne reakcje krwawienia widma masowego w porównaniu z innymi dostępnymi na rynku kolumnami osadzonymi polarnie. Niskie krwawienie fazy stacjonarnej skutkuje lepszym wykrywaniem śladowych zanieczyszczeń, ułatwia interpretację widma masowego i minimalizuje przestoje spowodowane zanieczyszczeniem źródła.
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?