Pochodna, hydroliza i analiza HPLC aminokwasów na kolumnach SUPELCOSIL™ i ASCENTIS^®

Wprowadzenie

W wielu przypadkach dokładna znajomość ilości białek jest wymagana do zastosowań w chemii białek. Analiza aminokwasów umożliwia precyzyjne określenie ilości białka i dostarcza szczegółowych informacji dotyczących względnego składu aminokwasów i wolnych aminokwasów. Względny skład aminokwasowy daje charakterystyczny profil dla białek, który często jest wystarczający do identyfikacji białek i jest często wykorzystywany jako czynnik decydujący o wyborze proteaz do fragmentacji białek.

Procedura obejmuje następujące kroki:

• Hydroliza
• Separacja
  
• Detekcja
  
• Określanie ilościowe

Hydroliza

Hydroliza jest zwykle osiągana przy użyciu warunków kwaśnych. Standardową procedurą jest hydroliza w 6 M kwasie solnym (24 godziny, 110 °C). Standardowa procedura jest kompromisem pomiędzy wymaganym czasem i temperaturą. Wrażliwe aminokwasy (zwłaszcza tryptofan i cysteina) zostaną częściowo zniszczone. Hydroliza w fazie gazowej i dodanie innych kwasów (np. kwasu propionowego, TFA, kwasu metanosulfonowego) mogą być wykorzystane do skrócenia czasu hydrolizy i poprawy wydajności wrażliwych aminokwasów.

Separacja, wykrywanie i kwantyfikacja

Hydrolizowane próbki (aminokwasy) są derywatyzowane w celu czułego wykrywania, rozdzielane przez HPLC. Derywatyzacja postkolumnowa była typowa; jednak derywatyzacja przedkolumnowa zyskała na znaczeniu i może być osiągnięta dzięki szerszemu zakresowi odczynników do derywatyzacji. Zastosowanie wewnętrznych i zewnętrznych standardów ma kluczowe znaczenie.

Wybór kolumny jest krytycznym czynnikiem przy projektowaniu eksperymentów. Kolumny SUPELCOSIL™ i ASCENTIS^® firmy Supelco są doskonałym wyborem, aby spełnić Twoje potrzeby w zakresie analizy aminokwasów.