CRISPR30

Plazmid kontroli pozytywnej CRISPR LacZ dla bakterii

• Kod UNSPSC: 41106617
• NACRES: NA.51

Właściwości

• Formularz: liquid
• opakowanie: vial of 50 μL
• stężenie: 20 ng/μL in TE buffer; DNA (1μg of purified plasmid DNA)
• metody: microbiological culture: suitable
• Zastosowanie: CRISPR; genome editing
• Promotor: Promoter activity: constitutive
• Warunki transportu: dry ice
• temp. przechowywania: −20°C

Opis

Opis ogólny

Ostatnie publikacje wykorzystujące rekombinację za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w E. coli wskazują na skuteczność edycji bliską 100%, co czyni rekombinację za pośrednictwem CRISPR/Cas9 najpotężniejszą jak dotąd metodą inżynierii genomu bakteryjnego. Ponadto, rekombinacja za pośrednictwem Cas9 przezwycięża zależność od drugiego etapu rekombinacji, unika tworzenia destabilizujących miejsc bliznowatych, może być stosowana w multipleksowaniu i jest mniej czasochłonna niż poprzednie protokoły.

Tutaj przedstawiamy nowatorski system λ-Red z podwójnym wektorem CRISPR/Cas dla ulepszonej rekombinacji w E. coli. Wykazano, że nasz system ułatwia ukierunkowaną homologicznie naprawę DSB utworzonych przez endonukleazę Cas9, umożliwiając zmiany genetyczne poprzez integrację chromosomalną DNA dawcy.

Plazmid ten należy stosować w połączeniu z plazmidem rekombinacji homologicznej Cas9 Lambda Red dla E. coli (CAS9BAC1P) jako kontrolę pozytywną dla niestandardowego eksperymentu edycji genów. Niestandardowe gRNA (CRISPRBACD) można zaprojektować i zamówić za pośrednictwem strony https://www.sigmaaldrich.com/pc/ui/genomics-home/customcrispr

Plazmid CRISPR LacZ Positive Control Plasmid for Bacteria (CRISPR30) zawiera odstęp gRNA ukierunkowany na gen lacZ w dzikim typie E. coli wyrażany konstytutywnie z promotora J23119, marker oporności na ampicylinę, źródło replikacji pBR322 i gen sacB z Bacillus subtilis do utwardzania opartego na kontr-selekcji.

Zastosowanie

Edycja genomu bakterii

• Rekombinacja za pomocą HR do analizy mutacji lub SNP
• Tworzenie linii komórkowych knock-in z promotorami, znacznikami fuzyjnymi lub reporterami zintegrowanymi z endogennymi genami.
• Tworzenie nokautów genów w liniach komórkowych E. coli

Inżynieria metaboliczna
Optymalizacja szczepu

Cechy i korzyści

Wydajność: zwiększona wydajność integracji za pośrednictwem HR
Bez markerów: nie wymaga wstawiania markerów oporności na antybiotyki
Bez blizn: brak sekwencji blizn po wycięciu markera, które często powodują rekombinację poza celem
Multipleksowanie: jednocześnie można używać wielu niestandardowych sekwencji gRNA

Zasada

Systemy CRISPR/Cas są wykorzystywane przez bakterie i archeony do obrony przed inwazją wirusów i plazmidów. Niedawno system CRISPR/Cas typu II z bakterii Streptococcus pyogenes został zaprojektowany tak, aby działał przy użyciu dwóch składników molekularnych: pojedynczego białka Cas9 i niekodującego RNA prowadzącego (gRNA). Endonukleazę Cas9 można zaprogramować za pomocą pojedynczego lub podwójnego gRNA, kierując dwuniciowe pęknięcie DNA (DSB) w pożądane miejsce genomu. Metody oparte na nukleazie są w dużej mierze toksyczne, gdy są stosowane jako narzędzia do edycji genów drobnoustrojów, ponieważ wiele bakterii nie posiada niezbędnych mechanizmów naprawy DNA występujących w systemach eukariotycznych. Jednakże, gdy CRISPR/Cas9 jest używany do pośredniczenia w rekombinacji, ta cytotoksyczna jakość oferuje przewagę, ponieważ indukowane przez Cas9 dwuniciowe pęknięcia zabijają komórki, które nie rekombinują z DNA dawcy. Zapewnia to nieodłączną metodę selekcji do edycji genów bez markerów i blizn, która jest znacznie wydajniejsza i bardziej podatna na multipleksowanie niż tradycyjne metody. Plazmid E. coli HR Positive Control (numer katalogowy CRISPR30) zawiera sekwencję gRNA ukierunkowaną na gen lacZ w dzikim typie bakterii E. coli i jest przeznaczony do stosowania w połączeniu z plazmidem E. coli HR Cas9 (numer katalogowy CAS9BAC1P) i szablonem dawcy ssDNA.

Informacje prawne

Umowa licencyjna na użytkowanieCRISPR.

Ta strona może zawierać tekst przetłumaczony maszynowo.

Informacja o środkach bezpieczeństwa

• Kod klasy składowania: 12 - Non Combustible Liquids
• Klasa zagrożenia wodnego (WGK): WGK 2
• Temperatura zapłonu (°F): Not applicable
• Temperatura zapłonu (°C): Not applicable