17-10188
Biosensor LentiBrite RFP-LC3 z kontrolnym mutantem lentiwirusowym
Synonim(y):
Białko związane z mikrotubulami 1A/1B łańcuch lekki 3, białko związane z autofagią LC3, związany z autofagią modyfikator ubikwityny LC3, MAP1A/MAP1B łańcuch lekki 3, białko związane z mikrotubulami 1 łańcuch lekki 3
Zaloguj sięWyświetlanie cen organizacyjnych i kontraktowych
About This Item
Kod UNSPSC:
12352207
eCl@ss:
34360190
NACRES:
NA.51
Polecane produkty
Opis ogólny
Przeczytaj naszą notę aplikacyjną w Nature Methods!
http://www.nature.com/app_notes/nmeth/2012/121007/pdf/an8620.pdf
(Kliknij tutaj!</A>)
Dowiedz się więcej o zaletach naszych LentiBrite Lentiviral Biosensors! Kliknij tutaj.
Biosensory mogą być wykorzystywane do wykrywania obecności/braku określonego białka, jak również subkomórkowej lokalizacji tego białka w żywej komórce. Znaczniki fluorescencyjne są często pożądane jako środek do wizualizacji interesującego białka w komórce za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub poklatkowego przechwytywania wideo. Wizualizacja żywych komórek bez zakłóceń pozwala badaczom obserwować warunki komórkowe w czasie rzeczywistym.
Systemy wektorów lentiwirusowych są popularnym narzędziem badawczym wykorzystywanym do wprowadzania produktów genowych do komórek. Transfekcja lentiwirusowa ma przewagę nad metodami niewirusowymi, takimi jak transfekcja chemiczna, w tym wyższą wydajność transfekcji komórek dzielących się i nie dzielących się, długotrwałą stabilną ekspresję transgenu i niską immunogenność.
EMD Millipore wprowadza LentiBrite Lentiviral Biosensors, nowy zestaw wstępnie zapakowanych cząstek lentiwirusowych kodujących ważne i podstawowe białka autofagii, apoptozy i struktury komórkowej do wizualizacji w różnych stanach komórek/chorób w analizie żywych komórek i in vitro.
- Wstępnie zapakowane, znakowane fluorescencyjnie za pomocą GFP i RFP
- Wyższa wydajność transfekcji w porównaniu z tradycyjnymi metodami opartymi na chemikaliach i innymi metodami transfekcji niewirusowej
- Zdolność do transfekcji dzielących się, nie dzielących się i trudnych do transfekcji typów komórek, takich jak komórki pierwotne lub macierzyste
-Brak zakłóceń funkcji komórkowych
Cząsteczki LentiBrite RFP-LC3-G120A firmy EMD Millipore służą jako kontrola negatywna obok RFP-LC3 typu dzikiego (katalog nr 17-10143) do analizy autofagii w żywych komórkach.
http://www.nature.com/app_notes/nmeth/2012/121007/pdf/an8620.pdf
(Kliknij tutaj!</A>)
Dowiedz się więcej o zaletach naszych LentiBrite Lentiviral Biosensors! Kliknij tutaj.
Biosensory mogą być wykorzystywane do wykrywania obecności/braku określonego białka, jak również subkomórkowej lokalizacji tego białka w żywej komórce. Znaczniki fluorescencyjne są często pożądane jako środek do wizualizacji interesującego białka w komórce za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub poklatkowego przechwytywania wideo. Wizualizacja żywych komórek bez zakłóceń pozwala badaczom obserwować warunki komórkowe w czasie rzeczywistym.
Systemy wektorów lentiwirusowych są popularnym narzędziem badawczym wykorzystywanym do wprowadzania produktów genowych do komórek. Transfekcja lentiwirusowa ma przewagę nad metodami niewirusowymi, takimi jak transfekcja chemiczna, w tym wyższą wydajność transfekcji komórek dzielących się i nie dzielących się, długotrwałą stabilną ekspresję transgenu i niską immunogenność.
EMD Millipore wprowadza LentiBrite Lentiviral Biosensors, nowy zestaw wstępnie zapakowanych cząstek lentiwirusowych kodujących ważne i podstawowe białka autofagii, apoptozy i struktury komórkowej do wizualizacji w różnych stanach komórek/chorób w analizie żywych komórek i in vitro.
- Wstępnie zapakowane, znakowane fluorescencyjnie za pomocą GFP i RFP
- Wyższa wydajność transfekcji w porównaniu z tradycyjnymi metodami opartymi na chemikaliach i innymi metodami transfekcji niewirusowej
- Zdolność do transfekcji dzielących się, nie dzielących się i trudnych do transfekcji typów komórek, takich jak komórki pierwotne lub macierzyste
-Brak zakłóceń funkcji komórkowych
Cząsteczki LentiBrite RFP-LC3-G120A firmy EMD Millipore służą jako kontrola negatywna obok RFP-LC3 typu dzikiego (katalog nr 17-10143) do analizy autofagii w żywych komórkach.
Autofagia, szlak degradacji wywołany stresem, odgrywa rolę w wielu chorobach, w tym nowotworach, neurodegeneracji i infekcjach. Członkowie rodziny LC3 odgrywają kluczową rolę w dojrzewaniu autofagosomu, centralnej organelli autofagii. Prekursory LC3 są proteolitycznie przetwarzane w celu utworzenia cytozolowego LC3-I. Po zainicjowaniu autofagii, C-końcowa glicyna jest modyfikowana przez dodanie fosfatydyloetanoloaminy (PE), tworząc LC3-II, który przemieszcza się do autofagosomów w punktowej dystrybucji. Konstrukty DNA kodujące białka fluorescencyjne połączone z LC3 są szeroko stosowane do monitorowania tworzenia autofagosomów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Zmutowana forma LC3 z C-końcową glicyną zmienioną na alaninę (LC3-G120A) nie jest w stanie zaakceptować modyfikacji PE i nie przenosi się do autofagosomu po indukcji autofagii.
Cząsteczki LentiBrite RFP-LC3-G120A firmy EMD Millipore służą jako kontrola negatywna obok RFP-LC3 typu dzikiego (nr katalogowy 17-10143) do analizy autofagii w żywych komórkach.
Zmutowana forma LC3 z C-końcową glicyną zmienioną na alaninę (LC3-G120A) nie jest w stanie zaakceptować modyfikacji PE i nie przenosi się do autofagosomu po indukcji autofagii.
Cząsteczki LentiBrite RFP-LC3-G120A firmy EMD Millipore służą jako kontrola negatywna obok RFP-LC3 typu dzikiego (nr katalogowy 17-10143) do analizy autofagii w żywych komórkach.
Zastosowanie
Obrazowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej:
(Patrz rysunek 1 w arkuszu danych)
Komórki HT-1080 umieszczono na szkiełku komorowym i transdukowano cząstkami lentiwirusowymi w MOI 20 przez 24 godziny. Po wymianie pożywki i 48 godzinach dalszej inkubacji, komórki pozostawiono w pełnej pożywce lub inkubowano przez 4 godziny w EBSS zawierającym inhibitor lizosomów, aby wywołać autofagię i zahamować lizosomalną degradację autofagosomów. Komórki utrwalono formaldehydem i zamontowano. Obrazy uzyskano za pomocą zanurzeniowej mikroskopii fluorescencyjnej szerokiego pola. Mutant kontrolny RFP-LC3 wykazuje rozproszoną dystrybucję jądrową i cytozolową zarówno w komórkach autofagicznych karmionych, jak i głodzonych (tj. brak translokacji do punktowej dystrybucji cytoplazmatycznej charakterystycznej dla LC3 typu dzikiego).
Porównanie immunocytochemiczne i analiza inhibitorów:
(Patrz rysunek 2 w arkuszu danych)
Podobnie jak na rysunku 1 (patrz arkusz danych), komórki HeLa umieszczono na szkiełku komorowym i transdukowano cząsteczkami lentiwirusowymi w MOI 20 przez 24 godziny. Po wymianie pożywki i dalszej 48-godzinnej inkubacji, komórki pozostawiono w pełnej pożywce, inkubowano przez 4 godziny w EBSS zawierającym inhibitor lizosomów w celu indukcji autofagii i zahamowania degradacji lizosomów lub inkubowano jak w poprzednim przypadku, z dodatkiem 5 mM 3-metyloadeniny (3-MA) jako inhibitora autofagii. 3-MA nie wpływa na lokalizację mutanta kontrolnego RFP-LC3. Barwienie immunocytochemiczne (zielony) tych samych pól widzenia przeciwciałem monoklonalnym przeciwko LC3A ujawnia podobny wzór ekspresji do zmutowanego białka (czerwony) w warunkach żywienia. Barwienie immunologiczne głodzonych komórek wykazuje punktowy rozkład endogennego LC3 typu dzikiego, podczas gdy sygnał po leczeniu 3-MA jest zmniejszony.
Trudne do transfekcji typy komórek:
(Patrz rysunek 3 w arkuszu danych)
Pierwotne typy komórek HUVEC (górny rząd) lub HuMSC (dolny rząd) umieszczono na szkiełkach komorowych i transdukowano cząsteczkami lentiwirusowymi w MOI 40 przez 24 godziny. Późniejsze leczenie komórek pozostawionych w pełnej pożywce lub komórek inkubowanych w EBSS z inhibitorem lizosomów przeprowadzono jak na rysunkach 1A i 1B (patrz arkusz danych).
Aby uzyskać optymalną wizualizację fluorescencji, zaleca się analizę docelowego poziomu ekspresji w ciągu 24-48 godzin po transfekcji/infekcji w celu optymalnej analizy żywych komórek, ponieważ intensywność fluorescencji może z czasem słabnąć, szczególnie w trudnych do transfekcji liniach komórkowych. Zainfekowane komórki można zamrozić po udanej transfekcji/infekcji i rozmrozić w hodowli, aby zachować dodatnią ekspresję fluorescencyjną przez ponad 24-48 godzin. Długość i intensywność ekspresji fluorescencyjnej różni się w zależności od linii komórkowej. W przypadku trudnych do transfekcji linii komórkowych może być wymagane wyższe MOI.
(Patrz rysunek 1 w arkuszu danych)
Komórki HT-1080 umieszczono na szkiełku komorowym i transdukowano cząstkami lentiwirusowymi w MOI 20 przez 24 godziny. Po wymianie pożywki i 48 godzinach dalszej inkubacji, komórki pozostawiono w pełnej pożywce lub inkubowano przez 4 godziny w EBSS zawierającym inhibitor lizosomów, aby wywołać autofagię i zahamować lizosomalną degradację autofagosomów. Komórki utrwalono formaldehydem i zamontowano. Obrazy uzyskano za pomocą zanurzeniowej mikroskopii fluorescencyjnej szerokiego pola. Mutant kontrolny RFP-LC3 wykazuje rozproszoną dystrybucję jądrową i cytozolową zarówno w komórkach autofagicznych karmionych, jak i głodzonych (tj. brak translokacji do punktowej dystrybucji cytoplazmatycznej charakterystycznej dla LC3 typu dzikiego).
Porównanie immunocytochemiczne i analiza inhibitorów:
(Patrz rysunek 2 w arkuszu danych)
Podobnie jak na rysunku 1 (patrz arkusz danych), komórki HeLa umieszczono na szkiełku komorowym i transdukowano cząsteczkami lentiwirusowymi w MOI 20 przez 24 godziny. Po wymianie pożywki i dalszej 48-godzinnej inkubacji, komórki pozostawiono w pełnej pożywce, inkubowano przez 4 godziny w EBSS zawierającym inhibitor lizosomów w celu indukcji autofagii i zahamowania degradacji lizosomów lub inkubowano jak w poprzednim przypadku, z dodatkiem 5 mM 3-metyloadeniny (3-MA) jako inhibitora autofagii. 3-MA nie wpływa na lokalizację mutanta kontrolnego RFP-LC3. Barwienie immunocytochemiczne (zielony) tych samych pól widzenia przeciwciałem monoklonalnym przeciwko LC3A ujawnia podobny wzór ekspresji do zmutowanego białka (czerwony) w warunkach żywienia. Barwienie immunologiczne głodzonych komórek wykazuje punktowy rozkład endogennego LC3 typu dzikiego, podczas gdy sygnał po leczeniu 3-MA jest zmniejszony.
Trudne do transfekcji typy komórek:
(Patrz rysunek 3 w arkuszu danych)
Pierwotne typy komórek HUVEC (górny rząd) lub HuMSC (dolny rząd) umieszczono na szkiełkach komorowych i transdukowano cząsteczkami lentiwirusowymi w MOI 40 przez 24 godziny. Późniejsze leczenie komórek pozostawionych w pełnej pożywce lub komórek inkubowanych w EBSS z inhibitorem lizosomów przeprowadzono jak na rysunkach 1A i 1B (patrz arkusz danych).
Aby uzyskać optymalną wizualizację fluorescencji, zaleca się analizę docelowego poziomu ekspresji w ciągu 24-48 godzin po transfekcji/infekcji w celu optymalnej analizy żywych komórek, ponieważ intensywność fluorescencji może z czasem słabnąć, szczególnie w trudnych do transfekcji liniach komórkowych. Zainfekowane komórki można zamrozić po udanej transfekcji/infekcji i rozmrozić w hodowli, aby zachować dodatnią ekspresję fluorescencyjną przez ponad 24-48 godzin. Długość i intensywność ekspresji fluorescencyjnej różni się w zależności od linii komórkowej. W przypadku trudnych do transfekcji linii komórkowych może być wymagane wyższe MOI.
Research Category
Apoptosis & Cancer
Neuroscience
Apoptosis & Cancer
Neuroscience
Research Sub Category
Apoptosis - Additional
Neurodegenerative Diseases
Apoptosis - Additional
Neurodegenerative Diseases
Komponenty
TagRFP-LC3-G120A Lentivirus:
One vial containing 25 µL of lentiviral particles at a minimum of 3 x 10E8 infectious units (IFU) per mL.
For lot-specific titer information, please see lot specific “Viral Titer” in the product specifications of the datasheet.
Promoter
EF-1 (Elongation Factor-1)
Multiplicty of Infection (MOI)
MOI = Ratio of # of infectious lentiviral particles (IFU) to # of cells being infected.
Typical MOI values for high transduction efficiency and signal intensity are in the range of 20-40. For this target, some cell types may require lower MOIs (e.g., HT-1080, HeLa), while others may require higher MOIs (e.g., human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), human mesenchymal stem cells (HuMSC), U2OS).
NOTE: MOI should be titrated and optimized by the end user for each cell type and lentiviral target to achieve desired transduction efficiency and signal intensity.
One vial containing 25 µL of lentiviral particles at a minimum of 3 x 10E8 infectious units (IFU) per mL.
For lot-specific titer information, please see lot specific “Viral Titer” in the product specifications of the datasheet.
Promoter
EF-1 (Elongation Factor-1)
Multiplicty of Infection (MOI)
MOI = Ratio of # of infectious lentiviral particles (IFU) to # of cells being infected.
Typical MOI values for high transduction efficiency and signal intensity are in the range of 20-40. For this target, some cell types may require lower MOIs (e.g., HT-1080, HeLa), while others may require higher MOIs (e.g., human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), human mesenchymal stem cells (HuMSC), U2OS).
NOTE: MOI should be titrated and optimized by the end user for each cell type and lentiviral target to achieve desired transduction efficiency and signal intensity.
Jakość
Evaluated by transduction of HT-1080 cells and fluorescent imaging performed for assessment of transduction efficiency.
Postać fizyczna
PEG precipitation
Przechowywanie i stabilność
Przechowywanie i obsługa
Lentiwirus jest stabilny przez co najmniej 4 miesiące od daty otrzymania, gdy jest przechowywany w temperaturze -80°C. Po pierwszym rozmrożeniu natychmiast umieścić na lodzie i zamrozić w podwielokrotnościach roboczych w temperaturze -80°C. Zamrożone podwielokrotności mogą być przechowywane przez co najmniej 2 miesiące. Dalsze zamrażanie/rozmrażanie może spowodować zmniejszenie miana wirusa i wydajności transdukcji.
WAŻNA UWAGA DOTYCZĄCA BEZPIECZEŃSTWA
Wektory lentiwirusowe z defektem replikacji, takie jak wektor 3. generacji dostarczony w tym produkcie, nie powodują żadnych chorób u ludzi ani zwierząt. Jednakże, lentiwirusy mogą integrować się z genomem komórki gospodarza i tym samym stwarzać pewne ryzyko mutagenezy insercyjnej. Materiał należy do grupy ryzyka 2 i powinien być obsługiwany pod kontrolą BSL2. Szczegółowe omówienie bezpieczeństwa biologicznego wektorów lentiwirusowych znajduje się w Pauwels, K. et al. (2009). Najnowocześniejsze wektory lentiwirusowe do zastosowań badawczych: Ocena ryzyka i zalecenia dotyczące bezpieczeństwa biologicznego. Curr. Gene Ther. 9: 459-474.
Lentiwirus jest stabilny przez co najmniej 4 miesiące od daty otrzymania, gdy jest przechowywany w temperaturze -80°C. Po pierwszym rozmrożeniu natychmiast umieścić na lodzie i zamrozić w podwielokrotnościach roboczych w temperaturze -80°C. Zamrożone podwielokrotności mogą być przechowywane przez co najmniej 2 miesiące. Dalsze zamrażanie/rozmrażanie może spowodować zmniejszenie miana wirusa i wydajności transdukcji.
WAŻNA UWAGA DOTYCZĄCA BEZPIECZEŃSTWA
Wektory lentiwirusowe z defektem replikacji, takie jak wektor 3. generacji dostarczony w tym produkcie, nie powodują żadnych chorób u ludzi ani zwierząt. Jednakże, lentiwirusy mogą integrować się z genomem komórki gospodarza i tym samym stwarzać pewne ryzyko mutagenezy insercyjnej. Materiał należy do grupy ryzyka 2 i powinien być obsługiwany pod kontrolą BSL2. Szczegółowe omówienie bezpieczeństwa biologicznego wektorów lentiwirusowych znajduje się w Pauwels, K. et al. (2009). Najnowocześniejsze wektory lentiwirusowe do zastosowań badawczych: Ocena ryzyka i zalecenia dotyczące bezpieczeństwa biologicznego. Curr. Gene Ther. 9: 459-474.
Informacje prawne
CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany
Ta strona może zawierać tekst przetłumaczony maszynowo.
Kod klasy składowania
10 - Combustible liquids
Klasa zagrożenia wodnego (WGK)
WGK 2
Certyfikaty analizy (CoA)
Poszukaj Certyfikaty analizy (CoA), wpisując numer partii/serii produktów. Numery serii i partii można znaleźć na etykiecie produktu po słowach „seria” lub „partia”.
Masz już ten produkt?
Dokumenty związane z niedawno zakupionymi produktami zostały zamieszczone w Bibliotece dokumentów.
Produkty
Testy autofagii oparte na komórkach, w tym biosensory lentiwirusowe LC3 GFP/RFP, zestawy do wykrywania autofagii oraz aktywatory i inhibitory autofagii.
High titer lentiviral particles for LC3 variants used for live cell analysis of cellular autophagy.
Nasz zespół naukowców ma doświadczenie we wszystkich obszarach badań, w tym w naukach przyrodniczych, materiałoznawstwie, syntezie chemicznej, chromatografii, analityce i wielu innych dziedzinach.
Skontaktuj się z zespołem ds. pomocy technicznej