고염 용해와 내염성 엔도뉴클레아제를 이용한 AAV 공정 강화

• 세포 용해에 대한 고려사항
• DNA 절단에 대한 고려사항
• AAV 벡터 생산을 위한 내염성 엔도뉴클레아제 개발
• 응용분야에 알맞은 Benzonase^® 선택하기
• 고염 문제 해결하기
• Benzonase^® FAQ
• Deviron^® FAQ

아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터 생산에는 세포 용해와 뉴클레아제 처리를 조합하는 중간 단계가 포함됩니다. 이 단계에서는 환자 안전 보장 및 다운스트림 공정의 효율성 개선을 위해 숙주 세포 DNA 및 잔류 플라스미드가 엔도뉴클레아제로 절단되는 동안, 세포의 지질 이중층을 분해하고 벡터를 방출하기 위해 세제가 사용됩니다. 유전자 치료 임상시험용 신약 신청을 위한 2020년 FDA 지침의 권장에 따라 잔류 DNA는 10 ng/dose 미만으로 감소해야 하고 절편 크기는 약 200 염기쌍 미만이어야 합니다.

이 페이지에서는 세포 용해에 대한 핵심 고려사항과 벡터 역가 및 감염력을 증가시키기 위해 고염 농도와 내염성 엔도뉴클레아제를 조합하여 사용하는 방법을 설명합니다.

세포 용해에 대한 고려사항

언뜻 보기에는 간단하게 보여도 세포 용해 단계에는 몇 가지 어려움이 있습니다. TRITON™ X-100(4-tert-octylphenol polyethoxylate)와 같이 세포 용해에 흔히 사용되는 세제가 문제될 수 있습니다. 2021년 1월부로, 유럽 위원회는 유럽 연합 내에서 TRITON™ X-100의 승인되지 않은 사용을 금지하였습니다. 해당 물질이 REACH(화학물질의 등록, 평가, 허가, 제한) 목록에 등재되었기 때문입니다. 등재된 이유는 유럽 내 사용과 관련된 엄격한 지침과 더불어 TRITON™ X-100 분해 산물이 내분비 및 돌연변이에 영향을 끼쳐서 환자와 환경에 위험한 것으로 밝혀졌기 때문입니다.

세포 용해용 세제 선택 시 추가적인 고려사항으로는 바이러스 벡터 및 바이러스 입자 감염력에 손상을 가하지 않아야 하고, polysorbate 사용으로 발생할 수 있는 다운스트림 공정을 방해하는 일이 없어야 합니다. 또한 선택된 세제는 이후 워크플로 단계에서 제거 및 검출될 수 있어야 합니다.

마지막으로 세포 용해 및 벡터 수확율에 염의 농도가 미치는 영향을 이해하는 것이 중요합니다. 과거에는 AAV 캡시드 방출을 위해 생리적 농도의 염(150mM NaCl)을 함유한 용해 버퍼가 사용되었습니다. 하지만 최근 간행물에 따르면 염 농도를 500mM까지 증가시키면 벡터 입자의 수와 감염 역가가 증가하고 AAV 응집이 감소한다고 보고되었습니다. 그러나 아래에 설명된 것처럼 고염은 AAV 벡터 제조 공정에서 DNA 절단에 사용되는 기존 엔도뉴클레아제의 활성도에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.

AAV 수확에 대한 중간 단계에서의 고염분의 영향

세포 용해 동안 더 높은 농도의 염이 미치는 영향을 측정하기 위해 연구가 수행되었습니다. AAV5 벡터는 각각 TRITON™ X-100, polysorbate 20, Deviron^® C16 또는 Deviron^® 13-S9로 용해된 HEK293 세포에서 생산되었습니다. 공정에 의해 생산된 캡시드의 기준선 생산량은 polysorbate 20 용해 버퍼에 함유된 150mM NaCl을 사용하여 측정되었습니다. 용해 버퍼에 함유된 500mM 염을 사용하면 AAV5 캡시드 역가가 평균 29% 증가하였습니다(그림 1).

그림 1. AAV5 역가 생산에 고염 용해가 미치는 영향.

표 1. AAV5 역가 생산에 고염 용해가 미치는 영향.

기준선: 150mM NaCl 및 Polysorbate 20​	기준선에 대한 효율성 비교
500mM NaCl + Polysorbate 20​	+16%​
500mM NaCl + TRITON™ X-100​	+39%​
500mM NaCl + Deviron® C16​	+37%​
500mM NaCl + Deviron® 13-S9​	+25%​

AAV 감염력에 중간 단계 동안 고염 농도가 미치는 영향

AAV 감염력에 500mM NaCl 조건이 미치는 영향을 측정하기 위해, HEK293 세포에서 제조된 AAV2 벡터로 유사한 연구가 수행되었습니다. 기준선 용해 버퍼 조건은 150mM NaCl 및 polysorbate 20이었습니다. 염 농도가 500mM로 증가되었고 다른 세제가 사용되었으며, 감염력 증가는 최소 10배로 관찰되었습니다(그림 2). 위에서 언급한 것처럼, 용해를 하는 동안 고염 농도를 사용하면 AAV 응집 감소라는 추가적인 이점이 있습니다.

그림 2. AAV5 감염력에 고염 용해가 미치는 영향.

표 2. AAV5 감염력에 고염 용해가 미치는 영향.

기준선: 150mM NaCl 및 Polysorbate 20​	기준선에 대한 효율성 비교
500mM NaCl + Polysorbate 20​	+1700%​
500mM NaCl + TRITON™ X-100​	+2200%​
500mM NaCl + Deviron® C16​	+1700%​
500mM NaCl + Deviron® 13-S9​	+2000%​

DNA 절단에 대한 고려사항

세포 용해 단계와 마찬가지로, DNA 절단 또한 몇 가지 어려움이 있습니다. 그중 가장 중요한 것은 규제 요건을 충족하고 공급망 견고성을 보장하는 적절한 품질의 원재료가 필요하다는 것입니다. GMP 준수 이외에도 순도, 글리코실화 상태, 생균 수 또한 그중 고려되는 요소입니다. 고염분에 대한 효소의 내성 또한 AAV 제조 동안 고염 농도 사용을 막는 중요한 요소입니다.

AAV 제조를 위한 효소 선택의 핵심 기준

1. IPEC PQG GMP 또는 동등한 표준 사용 가능, FDA DMF/BBMF
2. >99% 순수 제품
3. 번역 후 변형 없음
4. 마이코플라스마 검사
5. 외래성 바이러스 검사
6. 내독소 검사
7. 원재료 업체 제공 샘플(tailgate sample) 사용 가능
8. 강력한 물류 및 공급 강건성
9. 응용분야 관련 문의에 대한 기술 지원
10. 정밀한 검출법

DNA 절단에 사용되는 효소는 또한 다운스트림 공정 동안 효과적으로 제거되어야 하며 공정에 사용되는 염 농도에서 효소의 활성도를 고려해야 합니다. 더 높은 농도의 염은 벡터 수확율을 개선시킬 수 있는 반면, 높은 이온 강도에서는 기존 엔도뉴클레아제 효소와 DNA 간의 상호작용이 발생하지 않으므로 핵산이 절단되지 못하도록 합니다. 이는 과거에는 원하는 뉴클레아제 활성도와 염 농도가 적절하게 균형을 이루어야 했다는 것을 뜻합니다.

AAV 벡터 생산을 위한 내염성 엔도뉴클레아제 개발

세포 용해에서 선호되는 고염 농도에서 효율적인 활성도를 가진 엔도뉴클레아제의 필요성을 해결하기 위해, 머크는 Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제 개발에 첨단 단백질 공학 능력을 사용하였습니다. 이 비동물 유래 엔도뉴클레아제는 최대 1000mM 염 농도에서 DNA와 RNA를 절단할 수 있으며 IPEC, PQG, GMP를 준수하는 Emprove^® Expert 제품으로 출시됩니다.

박테리아 발현 시스템은 분자 크기를 정밀하게 정의하고 번역 후 변형이 없으며 배치 간 높은 재현성을 보장하므로 Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제를 생산하는 데 사용됩니다. 다음 데이터는 Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제의 활성도와 장점을 설명합니다.

단백질 프로파일

박테리아 발현 시스템은 분자 크기를 정밀하게 정의하고 번역 후 변형이 없으며 배치 간 높은 재현성을 보장하므로 Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제를 생산하는 데 사용됩니다. 이스트에서 발현된 효소가 과도하게 글리코실화되고 높은 배치 간 번역 후 가변성 프로파일을 가지는 것과는 달리, 균질한 단백질 프로파일은 면역분석(예: ELISA)을 통해 정확한 검출이 가능하도록 해 줍니다.

그림 3. 환원식 SDS-PAGE가 보여주는 Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제와 경쟁사 제품 A의 동일성과 순도.

그림 4. 비환원식 SDS-PAGE가 보여주는 Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제와 경쟁사 제품 A의 동일성과 순도.

Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제 Emprove^® Expert로 E.coli에서 생산하면 다음과 같은 특성을 보여줍니다.

• 깨끗하고 순수한 단백질
• 번역 후 변형 없음
• 높은 배치 간 정밀성

그림 3과 4에서 Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제 Emprove^® Expert는 정밀하게 정의된 분자 크기를 가진다는 결론을 보여줍니다. 고염에서 활성화되는 벤치마크 엔도뉴클레아제(경쟁사 제품 A)는 그렇지 않습니다.

엔도뉴클레아제 활성도

엔도뉴클레아제의 활성도는 마그네슘에 의존합니다. 그림 5에서는 Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제와 비내염성 뉴클레아제의 활성도를 각기 다른 마그네슘 농도에서 비교합니다. Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제 활성도는 고염 농도에 의해 강화되며 해당 활성도는 1~10mM 범위의 Mg²⁺ 및 500mM 염에서 안정적입니다. 150mM 및 500mM 염에서 Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제 활성도는 10mM Mg²⁺가 포함된 표준 뉴클레아제와 비슷합니다(그림 6).

그림 5. Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제와 비내염성 엔도뉴클레아제의 활성도 비교.

그림 6. Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제와 비내염성 엔도뉴클레아제의 활성도 비교.

그림 7에서는 500mM 및 1M NaCl 모두에서 1시간 동안 37°C라는 조건 하에 Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제와 기타 시판 중인 염활성 및 비염활성 엔도뉴클레아제 사용으로 DNA가 절단되었다는 연구 결과를 보여줍니다. Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제는 500mM과 1M의 염에서 DNA를 완전히 절단하였으며 기타 엔도뉴클레아제에 비해 유사하거나 더 나은 성능을 보여주었습니다.

그림 7. 37°C에서 1시간 동안 Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제와 시판 중인 염활성 및 비염활성 엔도뉴클레아제의 DNA 절단 비교.

범례

M – GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder 카탈로그 번호 SM1213

Comp A ** – 염활성 엔도뉴클레아제 경쟁사 제품

SE – 카탈로그 번호 103773과 유사한 표준 엔도뉴클레아제

STB – Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제 Emprove^® Expert

핵산 절편 크기

Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제는 DNA를 검출할 수 없는 수준으로 10 염기쌍 크기보다 작게 절단합니다. 그림 8에서는 저분자량 DNA 마커를 사용하여 4% 아가로스 겔에서 전개되는 DNA 절편을 보여줍니다. 150mM 염에서 DNA는 완전히 절단되지 않았습니다. 500mM 염에서는 절단 후 DNA 절편이 전혀 남아있지 않았습니다.

그림 8. Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제로 37°C에서 30분 동안 절단 후 25U/ml 크기의 DNA 절편.

AAV 벡터 생산에서 Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제와 세제의 적합성

세포 용해에 사용되는 4가지 각기 다른 세제와 함께 사용될 때 Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제의 활성도를 평가하였습니다. 사용된 세제는 TRITON™ X-100, polysorbate 20 그리고 TRITON™ X-100 금지에 대한 대응으로 개발된 Deviron^® C16 및 13-S9라는 두 가지 세제 대체제입니다. 그림 9에서 보여지듯이 Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제의 활성도는 4가지 세제 중 그 어떤 것에도 영향을 받지 않았습니다. DNA는 500mM NaCl 용해 버퍼에서 TRITON™ X-100, polysorbate 20, Deviron^® 13-S9 (7B)의 존재 하에 완전히 절단되었습니다.

그림 9. 각기 다른 세제와 조합하였을 때 Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제 활성도.

그림 10. 각기 다른 세제와 조합되었을 때 Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제의 DNA 절단.

응용분야에 알맞은 Benzonase^® 선택하기

Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제는 염 농도가 200mM 이상인 응용분야에 사용해야 합니다. 위에서 보았듯이, 500mM 염 농도에서 DNA는 완전히 절단되며 29% 증가된 AAV 역가와 거의 2,000% 증가된 감염력을 획득할 수 있습니다. 환자 안전성은 이 중간 단계에 고염 조건을 사용함으로써 증가합니다. AAV 응집을 지연시키고 바이러스 캡시드로부터 DNA의 효과적인 제거를 보장하기 때문입니다. 또한 Benzonase® 내염성 엔도뉴클레아제의 번역 후 프로파일은 약물 생산에서 글리코실화되지 않고 검출이 용이한 단백질을 사용하도록 보장합니다.

염 농도가 200mM 미만인 응용분야에서는 Benzonase^® Safety Plus 표준 엔도뉴클레아제를 사용해야 합니다.

표 3에 머크의 3가지 GMP Benzonase^® 엔도뉴클레아제 참조 물질의 규격이 요약되어 있습니다. Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제는 Emprove^® 프로그램의 일부이며 이 프로그램은 개발 단계에서 제조 단계로 넘어갈 때 제조사가 중단을 최소화하고 철저한 위험성 평가를 수행하도록 도와 줍니다. 또한 선도적인 산업 표준에 따라 엄격하게 자격을 취득한 원재료 및 출발 물질을 제공합니다. 프로그램의 일부인 물질은 포괄적인 문서화 패키지의 지원을 받습니다. 이 문서화 패키지를 통해 제약 업체가 원재료의 자격을 취득하고, 위험성 평가를 완료하고, 제조 공정을 최적화할 때 필요한 정보가 충족됩니다.

표 3. 표준 및 Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제의 규격.

규격	표준 Benzonase® 엔도뉴클레아제	Benzonase® 엔도뉴클레아제 Safety Plus Emprove® Expert	Benzonase® 내염성 엔도뉴클레아제 Emprove® Expert
마이코플라스마에 대한 로트 출하 검사	아니요	예	예
BioReliance를 이용하여 외래성 바이러스(3 세포주) 부재를 확인하는 체외 로트 출하 검사	아니요	예	요청 즉시
비동물 유래임을 주장하기 위해 화학적으로 구명된 발효 배지	아니요	예 (동물 유래 없음)	예 (동물 유래 없음)
미생물 검사	< 10 CFU/100,000 U	< 10 CFU/100,000 U	< 10 CFU/100,000 U
내독소 (LAL)	< 0.25 EU/1,000 U	< 0.25 EU/1,000 U	< 0.25 EU/1,000 U
FDA 원료의약품등록(DMF)	예	예	예
온도 스트립과 함께 배송	아니요	예	예 (5MiU 미만에 대해 요청 즉시)
원재료 업체 제공 샘플 (Tailgate sample)	아니요	예 (5백만 단위 크기)	예 (5백만 단위 크기)
제품 재고 정보	모든 Benzonase® 제품은 포트폴리오에서 계속 유지됩니다		적격성 평가를 위해 3 IPEC PQG 배치 구매 가능

고염 문제 해결하기

AAV 생산에서 세포 용해 단계 동안 고염 농도를 사용하면 더 높은 역가와 개선된 감염력을 산출합니다. 과거에는 고염 상태가 DNA 절단에 사용되는 기존 엔도뉴클레아제의 활성도를 억제하기 때문에 이런 접근법이 비실용적이었습니다.

Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제의 유용성 덕분에 중간 용해 및 DNA 절단 단계 동안 약 500mM의 염 농도를 혼합할 수 있게 되었고 TRITON™ X-100의 대체제 역할을 할 수 있는 Deviron^® 세제를 포함하여 모든 검사 완료 세제에 적합성이 있습니다.

Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제 또는 Deviron^® 포트폴리오 제품 각각의 샘플을 요청하려면, 아래의 링크를 클릭하여 당사의 웹 양식을 간단하게 작성하시기 바랍니다.

Benzonase^® FAQ

정의

Benzonase^® 엔도뉴클레아제란 무엇인가요?

Benzonase^® 엔도뉴클레아제는 Merck가 소유한 엔도뉴클레아제의 상표명이며 연구 및 바이오 공정에 사용됩니다.

이 상표명으로 어떤 효소를 찾아볼 수 있나요?

Benzonase^® 엔도뉴클레아제 제품군은 현재 2가지 각기 다른 효소를 보유하고 있습니다.

• Benzonase^® 엔도뉴클레아제 Safety Plus와 같은 레거시 Benzonase^® 엔도뉴클레아제 제품 라인은 Serratia marcescens에서 분리되고 E. coli K12 균주 W3110에서 재조합되어 생산되었습니다. 해당 단백질의 분자량은 30 kDa이고 등전점(PI)은 6.85입니다.
• 새로운 Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제(1.4445). 이 제품은 고염 농도에서 가장 높은 활성도를 보장하기 위해 최첨단 단백질 공학 능력으로 설계되었습니다.

해당 단백질은 단량체이며 분자량은 약 27 kDa, pH 9.68에서 해당 PI입니다. 이 FAQ의 전용 섹션에서 이 효소에 대해 구체적으로 다룹니다.

활성 방식

어떤 유형의 핵산이 Benzonase^® 뉴클레아제와 작용하나요? RNA를 분리할 때도 이 제품을 사용할 수 있나요?

Benzonase^® 뉴클레아제는 무차별적인 엔도뉴클레아제이며 모든 형태의 DNA 및 RNA(단일 가닥, 이중 가닥, 선형 및 원형)에 달려들어 분해합니다.

Benzonase^® 뉴클레아제가 완전히 핵산을 분해한 최종 결과는 무엇인가요?

Benzonase^® 뉴클레아제는 5’-모노포스페이트로 종결된 올리고뉴클레오티드까지 핵산을 완전히 절단하며 2~5개 염기 길이입니다.

억제 및 제거

Benzonase^® 뉴클레아제는 어떻게 불활성화되나요? 어떻게 제거할 수 있나요?

필수 금속 이온을 킬레이트하는 EDTA를 사용하여 가역 억제를 할 수 있습니다. 비가역성 불활성화는 극단적인 조건(70°C에서 30분 동안 100 mM NaOH)에서만 달성 가능합니다. Benzonase는 크로마토그래피를 사용하여 대상으로부터 분리할 수 있습니다. 하지만 이 엔도뉴클레아제의 강건한 성질 때문에 뉴클레아제가 없는 최종 생성물이 필요한 경우에는 Benzonase를 사용하지 않는 것을 권장합니다.

Benzonase^® 엔도뉴클레아제가 작용하지 않는 이유는 무엇인가요? 무엇이 활성도를 억제하나요?

Benzonase^® 엔도뉴클레아제는 광범위한 작업 조건 하에서 활성화합니다( 효소 특성 문단을 확인). 하지만 Benzonase^® 엔도뉴클레아제를 활성화하려면 1~2 mM 농도의 Mg2+가 필수입니다.

Mn2+는 Mg2+를 대체할 수 있지만 효소는 Mg2+가 존재할 때만 최적의 활성도에 도달합니다. 1가 양이온 농도 >300 mM, 인산염 농도 >100 mM, 암모늄설페이트 농도 >100 mM에 의해 억제됩니다(약 50% 활성도). 그 외에도, EDTA 농도 >1 mM인 경우에도 Benzonase^® 엔도뉴클레아제 활성도를 억제합니다.

활성도 감소가 관찰됩니다. 이유가 무엇인가요?

Benzonase^® 엔도뉴클레아제는 대개 매우 안정적이지만 드문 경우에 활성도 감소가 관찰될 수 있습니다. 여기에는 몇 가지 가능성 있는 이유가 있습니다. 프로테아제 같은 시료 내 변성 시약의 존재 때문에 비가역성 불활성화가 생길 수 있거나, 아니면 잘못된 보관 때문일 수 있습니다. 가역성 불활성화는 일반적으로 EDTA 같은 킬레이트화 시약의 존재가 필수 마그네슘 이온을 제거하기 때문에 생깁니다.

바이오 공정 주형에서 Benzonase^® 엔도뉴클레아제를 어떻게 제거하나요?

정화를 위한 심층 여과, 농축을 위한 접선유동여과(TFF) 및 정용여과, 크로마토그래피(IEX, SEC, HIC) 같은 여러 다운스트림 운영 단위에서 Benzonase^® 엔도뉴클레아제를 제거할 수 있습니다. 자세한 정보는 부록, 챕터 2 "Benzonase^® 엔도뉴클레아제의 제거"(36 페이지)를 확인하세요.

안정성 및 운전 조건

Benzonase^® 엔도뉴클레아제를 실험대 위에 방치하였습니다. 계속 그렇게 두어도 괜찮나요?

Benzonase^® 엔도뉴클레아제는 강도 높은 안정성 검사를 받았으며 해당 제품은 극도로 안정적인 것으로 밝혀졌습니다. 37°C에서 배양을 연장하는 경우에도 Benzonase^® 엔도뉴클레아제는 90%를 능가하는 활성도를 몇 달 동안 유지하였습니다.

다른 버퍼를 사용하고 싶습니다. Benzonase^® 엔도뉴클레아제를 완전히 활성화하는 데 필요한 조건은 무엇인가요? 무엇이 활성도를 억제하나요?

Benzonase^® 엔도뉴클레아제를 활성화하려면 1~2 mM Mg2+가 필요합니다. Benzonase는 1가 양이온 농도 >50%, 인산염 농도 >20 mM, 암모늄설페이트 농도 >25 mM에 의해 억제됩니다(약 50% 활성도).

낮은 온도에서 작업하고 있다면 Benzonase^® 엔도뉴클레아제를 얼마나 더 많이 추가해야 하나요?

Benzonase^® 엔도뉴클레아제를 활성화하려면 1~2 mM Mg2+가 필요합니다. Benzonase는 1가 양이온 농도 >50%, 인산염 농도 >20 mM, 암모늄설페이트 농도 >25 mM에 의해 억제됩니다(약 50% 활성도).

단백질 추출 응용분야

Benzonase^® 엔도뉴클레아제는 프로테아제 억제제 혼합물에 적합성이 있나요?

예. 하지만 많은 프로테아제 억제제 혼합물에는 EDTA가 포함되어 있으므로 주의가 필요합니다. EDTA 농도가 1 mM보다 높으면 Benzonase^® 엔도뉴클레아제 활성을 억제합니다.

단백질이 불용성인데 변성 조건 하에서 정제를 수행해야 합니다. Benzonase^® 엔도뉴클레아제가 요소(Urea)에도 효과가 있을까요?

Benzonase^® 엔도뉴클레아제 활성은 요소가 최대 6M의 농도로 존재할 때 실제로 증가합니다. 6M 요소에서 효소 활성이 처음에는 증가하고 시간이 지남에 따라 감소합니다. 7M 요소에서 Benzonase^® 엔도뉴클레아제는 15분 뒤 변성되며 활성도를 잃습니다. 하지만 불활성화 이전에 상당한 양의 핵산이 분해됩니다. Benzonase^® 엔도뉴클레아제의 초기 농도가 높으면 7M 요소의 영향을 부분적으로 보상합니다.

Benzonase^® 엔도뉴클레아제 변형 제품이 왜 그렇게 다양한가요? HC는 무슨 뜻인가요? 99%에 비해 90% 순도는 어떤 영향을 미치나요?

최대한 공정 가능 범위를 넓히고 비용 요건을 충족하기 위해, Benzonase^® 엔도뉴클레아제는 두 가지 다른 순도로 사용 가능합니다. 순도 등급 I(>99% 순도)와 순도 등급 II(>90% 순도). 두 등급 모두 25 U/μL에서 또는 고농도(HC)인 250 U/μL에서 사용 가능합니다. 대량 구매는 고객 서비스에 문의하세요.

Benzonase^® 제품들과 제품 간의 차이에 대한 전체 목록은 당사의 엔도뉴클레아제 페이지를 방문하세요.

Benzonase^® 엔도뉴클레아제가 완전히 핵산을 분해한 최종 결과는 무엇인가요?

Benzonase^® 엔도뉴클레아제는 5’-모노포스페이트로 종결된 올리고뉴클레오티드까지 핵산을 완전히 절단하며 2~5개 염기 길이입니다.

바이오제조 응용분야

특정 응용분야에 대해 어떤 품질/수량의 Benzonase^® 엔도뉴클레아제가 적합할까요?

Benzonase^® 엔도뉴클레아제의 활성에 영향을 미치는 몇 가지 매개변수가 존재합니다. 그러므로 최적의 조건은 공정마다 다양할 수 있으며 실험실적으로 결정되어야 합니다. 점도 감소를 위해 Benzonase^® 엔도뉴클레아제는 순도 등급 II(≥ 90%)로 대개 충분합니다. 표준 분석 조건 하에서 Benzonase^® 엔도뉴클레아제 1단위는 대략 37µg의 DNA를 30분 내에 완전히 절단하는 데 요구되는 효소의 양에 상응합니다.

Benzonase^® 엔도뉴클레아제를 기존 공정에서 어느 단계에 도입해야 하나요?

이 질문에 대한 대답은 Benzonase^® 엔도뉴클레아제를 사용하는 이유에 따라 매우 다양할 수 있습니다. 예시로 든 응용분야가 이 질문에 대한 답을 얻는 데 도움이 되기를 바랍니다. 하지만 일반적으로 Benzonase^® 엔도뉴클레아제는 주로 배양 후와 포집 단계 이전에 가장 잘 추가됩니다.

Benzonase^® 엔도뉴클레아제는 안전한가요?

예, Benzonase^® 엔도뉴클레아제의 독성학적 연구가 수행되었습니다(내부 보고서 열람 가능). 마우스와 래트에서 단일 적용 후 전신 독성이 조사되었습니다. 매우 고투여량에서도 독성 효과는 전혀 관찰되지 않았습니다. 그 외에도, Benzonase^® 엔도뉴클레아제를 매우 고투여량으로 정맥내 처치를 받은 마우스에서도 돌연변이 유발 가능성이 관찰되지 않았습니다.

5백만 단위 튜브의 충전 범위 용량이 명시되지 않는 이유는 무엇인가요?

Benzonase^® 엔도뉴클레아제의 활성(U/mL)은 제품 로트 간에 다양할 수 있으므로 용량이 아니라 튜브당 단위를 명시하기로 결정하였습니다. 튜브당 용량은 시험성적서(CoA)에 있는 활성도 정보로부터 쉽게 계산할 수 있습니다.

BENZONASE^® 내염성 엔도뉴클레아제

염기서열은 Benzonase^® Safety Plus와 같은 레거시 Benzonase^® 제품과 유사한가요?

Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제는 완전히 새로운 효소로서 고염 농도에서 가장 높은 활성도를 보장하도록 최첨단 단백질 공학을 통해 설계되었습니다. 이 제품은 기타 Benzonase^® 레거시 제품과 비교해 볼 때 다른 아미노산 염기서열을 가지고 있습니다.

사용과 관련하여 레거시 Benzonase^® 제품과 다른 점은 무엇인가요?

엔도뉴클레아제로서 Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제는 레거시 Benzonase^® 제품과 같은 조건에서 작용합니다. 예외로는 1가 양이온 농도가 있는데, 최소 300mM NaCl을 추천합니다.

이 효소를 어떻게 억제하나요?

이 효소는 EDTA를 추가하거나 열에 노출시키면 억제됩니다.

이 효소를 어떻게 제거하나요?

위에 나와있는 "바이오 공정 주형에서 Benzonase^® 엔도뉴클레아제를 어떻게 제거하나요?"를 참조하세요.

이 효소의 흔적을 어떻게 검출하나요?

당사의 레거시 Benzonase^® 효소에 대한 전용 Elisa 키트는 Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제를 확실하게 검출하도록 보장합니다.

다른 표준 뉴클레아제가 아니라 이 효소를 사용해야 하는 이유는 무엇인가요?

바이오공정에 사용되는 모든 시판 중인 표준 뉴클레아제는 매우 유사한 아미노산 염기서열을 기반으로 합니다. 이것은 고염에서 핵산을 절단하는 능력이 비슷하고 최적화되지 않은 것으로 여겨진다는 뜻입니다.

해당 효소들이 1가 양이온 농도에 대해 효과적으로 작용하는 조건의 범위는 0~200mM입니다. 바이오공정에서 유사한 생리적 염 농도가 확인되었습니다.

동시에, HEK 세포 용해 동안 생리적 농도를 넘어서는 더 높은 농도의 염을 사용하면 전반적인 공정 수확율에 실질적인 영향을 미치고 있는 것으로 나타났습니다. 500mM NaCl 농도에서, 감염력과 전반적인 AAV 회수율은 150mM 염 농도보다 유의미하게 더 높습니다.

이러한 고염 조건에서 핵산을 제거하기 위해서는 내염성 엔도뉴클레아제 사용이 필수적입니다.

200mM를 초과하는 염 농도에서도 보통의 뉴클레아제를 사용할 수 있나요?

생리적 염 농도보다 더 높은 염 농도에서 보통의 뉴클레아제는 활성도가 급격하게 감소되어 더 많은 효소 추가로 이어지고 약물 정제 공정을 복잡하게 만들 것입니다. 또한 이로 인해 공정의 비용 효율이 나빠지고 소유 비용이 증가하는 결과를 초래합니다. 그런 이유로 내염성 뉴클레아제 사용을 권장합니다.

Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제 검출에 다른 공급업체의 검출 키트를 사용할 수 있나요? 다른 "염활성" 뉴클레아제용으로 특화된 다른 키트 같은 것을 사용할 수 있나요?

Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제는 완전히 새로운 효소이며, 당사의 자체 검출 키트가 아닌 시판 중인 다른 키트로는 검출할 수 없습니다.

참고: 공식 Merck 채널을 통한 상표명 “Benzonase^®”를 사용하는 제품이 아니면 모조품으로 간주해야 합니다.

효소 생산에서 숙주 발현이 그렇게나 중요한 이유는 무엇인가요?

단백질 발현은 여러 제품 플랫폼으로 달성될 수 있습니다. 이스트 기반 및 박테리아 기반 발현이 가장 일반적입니다. 아직은 생산 결과물이 유사하지 않으며 번역 후 변형 프로파일은 사용되는 플랫폼에 따라 다릅니다.

이스트 발현 단백질은 과도하게 글리코실화되고 변형되어 제품 사용 동안 항체 분석에서 검출 정확도가 낮아지는 등의 여러 문제로 이어질 수 있습니다.

시판 중인 주요 염활성 엔도뉴클레아제는 이스트에서 발현됩니다.

뉴클레아제의 번역 후 변형이 검출 정확도와 효율성에 영향을 미치는 이유는 무엇인가요?

글리코실화 단백질은 비균질한 프로파일(그림 2에서 확인되듯이)을 보여주며 배치 간 재현성이 없습니다. 표준 검출 방법에서 면역분석을 사용하기 때문에 관심 단백질을 검출하기 위해 만들어진 항체는 이스트 발현으로 관찰되는 스펙트럼 변화 전체를 다룰 수 없습니다. 이로 인해 Elisa 키트와 같은 항체 기반 검출법의 검출 정확도가 낮아집니다.

이 효소의 독성학적 프로파일은 무엇인가요?

Benzonase^® 내염성 엔도뉴클레아제는 Benzonase^® 포트폴리오의 다른 제품과 같이 동일한 독성학적 프로파일을 가지고 있습니다.

기존 공정에 가장 비용 효율적인 뉴클레아제를 정하도록 도움을 주나요? 전반적인 효율성과 수확율을 명심하세요.

머크는 규제 및 공정 조건에 필요한 점을 충족하는 완전한 뉴클레아제 포트폴리오를 보유하고 있습니다. 귀사의 공정 개발에 대해 머크의 MSAT(Manufacturing Science And Technology) 지원 팀에 부담 없이 문의하세요. 당사의 전문가는 업스트림에서 최종 충전까지 모든 제조 주형을 다룹니다.

Deviron^® FAQ

유럽 연합에 위치하고 있지 않다면 TRITON™ X-100을 계속 사용할 수 있나요?

TRITON™ X-100 금지는 REACH² 규정 하에 ECHA¹에 의해 결정되었습니다. 주요한 동인은 인체 건강과 환경에 대한 해당 제품의 높은 독성이었습니다. 그러므로 생물공정에서 이 제품을 제거하는 것은 업계의 가장 뜨거운 추세 중 하나입니다. 비EU 규제기관도 해당 제품 사용을 평가할 것이며, 앞으로 다른 금지 조치로 이어질 것입니다.

생물제조에 연구 등급 세제를 사용할 수 없는 이유가 무엇인가요?

세제는 일반적으로 유기화학 연쇄반응으로 대량 제조됩니다. 흔히 생산 비용 절감을 위해 원재료 품질이 불량합니다. 이는 최종 제품에서 다이옥신이나 니트로사민과 같이 매우 위험한 불순물을 초래합니다. 이러한 연구 등급 세제는 오직 애플리케이션을 세척하는 데에만 사용되며 약물 제형 근처에서 발견되어서는 안 됩니다.

Deviron^®로 변경하는 핵심 단계는 무엇인가요?

Deviron^® 포트폴리오에는 사용 가능한 GMP EXCiPACT 제조 제품의 배치가 3가지 있습니다. 이러한 배치 샘플은 이미 적격성 평가 목적으로 요청될 수 있습니다. 당사 제품과 함께 오는 Emprove^® 문서에는 규제 기관에 서류를 제출하기 위해 필요한 모든 정보가 들어 있습니다. 독성학적 정보 또한 즉시 사용 가능합니다.

Deviron^®를 시험삼아 사용해보고 싶은데 전문 지식이 없습니다. 어떤 지원을 받을 수 있나요?

응용분야 관련 지원을 위해, 당사의 생물제조 전문가 팀의 도움을 받을 수 있습니다. 이러한 변화를 시도하는 동안 조언을 드립니다. 머크 담당자에게 연락하여 무료 지원을 받으세요.

MQ400/Emprove^® Evolve와 MQ500/Emprove^® Expert(GMP)의 차이는 무엇인가요?

규제 서류 제출을 돕기 위해 당사는 각기 다른 문서화 및 품질 프로그램을 만들었습니다. 귀사가 올바른 응용분야를 위한 올바른 제품을 사용하도록 도와 드립니다. 다음 링크를 클릭하여 Emprove^®와 M-Clarity^® 프로그램에 대해 자세히 알아보세요. Deviron^® C16 Emprove^® Evolve와 Deviron^® 13-S9 Emprove^® Expert는 당사가 제공하는 최고 품질 수준의 일부입니다.

대상 응용분야를 위한 권장 농도는 무엇인가요?

바이러스 불활성화를 위해, TRITON™ X-100에 사용되는 ASTM³ E3042-16은 오늘날까지 여전히 단클론 항체 제조를 위해 선택하는 문서입니다. 해당 산업 분야에서 사용되는 농도는 응용분야에 따라 0.5~1% 사이로 다양합니다.

세포 용해 응용분야를 위해, 광범위한 농도가 사용되며 모두 공정에 특화되어 있습니다. 공정 개발 동안 여러 농도를 병행하여 시도하는 것을 추천합니다. 당사의 Deviron^® 세제는 적어도 TRITON™ X-100 또는 polysorbate만큼 효율적입니다.

Deviron^®을 위한 GMP 검출법을 우리가 개발할 수 있나요?

머크의 R&D 전문가들은 당사의 Deviron^® 포트폴리오를 위해 검출법을 개발하였으며 이를 그대로 고객에게 전달할 수 있습니다. 하지만 GMP 검출법을 위해 당사의 Bioreliance^® 실험실을 파트너로 선택합니다. 문의 사항이 있으시면 당사로 연락하십시오.

Deviron^® 포트폴리오는 세포 용해 응용분야용 Benzonase^®와 적합성이 있나요?

Benzonase^®는 AAV⁴ 공정에서 DNA 절단을 위한 황금 표준입니다. Deviron^® 포트폴리오는 Benzonase^® 엔도뉴클레아제에 완전히 적합성이 있도록 개발되었습니다. 두 포트폴리오를 함께 사용하는 경우 효소 활성도나 세제 특성의 소실이 없습니다. 응용분야 데이터는 Deviron^® 포트폴리오 안내책자에서 찾아보실 수 있습니다.

Deviron^® 포트폴리오의 제조 용량은 어떻게 되나요?

Deviron^® 포트폴리오는 당사의 독일 다름슈타트 현장에서 출시되었으며 이미 매년 100톤이 넘는 제품을 제공할 수 있습니다. 케이스에 따라 구체적인 리드 타임을 논의하기 위해 예측되는 사항을 당사에게 부담 없이 알려주세요.

¹유럽 화학물질청
²화학물질의 등록, 평가, 승인 및 제한*
³검사 방법에 대한 미국 표준
⁴아데노 관련 바이러스
TRITON은 Dow Chemical Company(“Dow”) 또는 Dow의 계열사의 상표이며 라이선스 하에 사용됩니다.

참고문헌

1. 2020. Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs). [Internet]. U.S. Drug & Food Administration. Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/chemistry-manufacturing-and-control-cmc-information-human-gene-therapy-investigational-new-drug

머크는 최선의 지식과 능력에 따라서 정보 및 권고사항을 당사의 고객에게 제공하지만, 의무 또는 책무를 보장하지 않습니다. 당사의 고객은 모든 경우에 기존의 법과 규정을 준수해야 합니다. 이는 제삼자의 모든 권리에 대해서도 적용됩니다. 당사의 정보 및 권고사항은 예상된 목적을 위해 당사 제품의 적합성을 확인해야 하는 당사 고객 자신의 책임을 면제하지는 않습니다.