ホスファターゼ阻害剤カクテル

Ian Gleiser, Pnina Yaish, Efrat Barnea-Gedalyahu, Dorit Zharhary

はじめに

リン酸化は可逆的なタンパク質の翻訳後修飾です。プロテインキナーゼは、負に帯電したγ-リン酸基をATPからタンパク質のセリン、トレオニン、チロシン残基の水酸基側鎖に転移させ、タンパク質の構造と活性を変化させます。その逆の反応、すなわちタンパク質からのリン酸の除去（脱リン酸化）は、プロテインホスファターゼによって行われます。^1,2哺乳類のタンパク質の3～4%はキナーゼとホスファターゼであり、いくつかの標的タンパク質に特異的なものもあれば、多くのタンパク質に広く作用するものもあります。

タンパク質のリン酸化は、タンパク質の活性、相互作用、局在、分解を制御する重要な調節機構です。シグナル伝達、細胞周期、アポトーシス、代謝などのプロセスを制御します。哺乳類の典型的な細胞に存在するタンパク質の約3分の1はリン酸化を受け、その多くは複数部位がリン酸化されます。セリンのリン酸化はリン酸化プロテオームの86%を占め、トレオニンおよびチロシンのリン酸化はそれぞれ12%、2%を占めます。多くのヒト疾患が細胞タンパク質の異常なリン酸化に関連しています。^3-5

タンパク質のリン酸化・脱リン酸化を制御機構として利用することは細胞にとって多くの利点があります。これらには新たなタンパク質の合成やタンパク質の分解が不要で、迅速かつ可逆的な反応である点です。

シグナル伝達カスケードやタンパク質間相互作用のようなタンパク質リン酸化を含む細胞過程の研究、あるいはタンパク質のリン酸化部位の分析やリン酸化タンパク質の精製では、ホスファターゼ阻害剤で細胞タンパク質ホスファターゼを阻害することが不可欠です。これにより、特定の時点における標的タンパク質のリン酸化状態を保つことができます。リン酸化データベース（www.phosphosite.org）には80,000のリン酸化部位が登録されています。そのほとんどは、ホスファターゼ阻害剤を使用しなければ検出できなかった部位です。

プロテインホスファターゼ

プロテインホスファターゼは、その基質特異性に基づいてさらに細かく分類されます（表1)。

アルカリホスファターゼ^6-8–タンパク質、ヌクレオチド、アルカロイドなど、さまざまな分子種からリン酸基を除去する非特異的ホスファターゼファミリー。哺乳類のアルカリホスファターゼアイソザイムは、ホモアルギニンおよびレバミゾール類似体によって阻害されます。しかし、腸および胎盤のアイソザイムはレバミゾールで阻害されず、イミダゾールで阻害されます。
タンパク質セリン／トレオニンホスファターゼ^9,10–このクラスのリン酸化タンパク質ホスファターゼが、in vivoのセリン／トレオニンホスファターゼ活性の大半を占めます。PP1およびPP2の2つの主要下位クラスが含まれます。後者は金属イオンの必要量を基準に、金属イオンを必要としないPP2A、カルシウムで刺激されるPP2B、Mg²⁺依存性のPP2Cに細分されます。セリン／トレオニンホスファターゼは、海綿、土壌放線菌などに由来する多くの低分子によって阻害されます。よく知られているのは、オカダ酸、カリクリンA、ミクロシスチン-LR、タウトマイシン、フォストリエシン、カンタリジンです。こうした化合物の作用は、セリン／トレオニンホスファターゼの種類により異なる特異性を示します。¹¹
タンパク質チロシンホスファターゼ¹²–システイニル-リン酸酵素中間体を用いて、タンパク質のリン酸化チロシン残基からリン酸基を除去する酵素群。この酵素群は、シグナル伝達経路における重要な調節因子です。チロシンホスファターゼは、オルトバナジン酸やその関連化合物、およびフッ化ナトリウムによって阻害されます。
二重特異性（TyrおよびSer/Thr）ホスファターゼ³–二重特異性ホスファターゼは、セリンおよびトレオニン残基の両方を脱リン酸化できるタンパク質チロシンホスファターゼの下位クラスです。重要な細胞シグナル伝達経路の調節に関与しています。阻害剤の具体例については参考文献をご覧ください。¹³

ホスファターゼ阻害剤カクテル

すべてのリン酸化実験において、ホスファターゼ阻害剤の使用は不可欠です。私たちは、タンパク質を脱リン酸化から確実に保護するために、各種ホスファターゼを網羅するホスファターゼ阻害剤カクテルを提供しています。本シリーズには、ホスファターゼ阻害剤カクテル2（カタログ番号P5726)、ホスファターゼ阻害剤カクテル3（カタログ番号P0044）の2種類のカクテルがあります。新製品のホスファターゼ阻害剤カクテル3は、Ser/Thrホスファターゼ用のホスファターゼ阻害剤の混合物です。ホスファターゼ阻害剤カクテル3はホスファターゼ阻害剤カクテル1（カタログ番号P2850）の後継品です。この2種類のカクテルの違いは、新しいホスファターゼ阻害剤カクテル3は、ホスファターゼ阻害剤カクテル1のミクロシスチン-LRの代わりにカリクリンAを含む点です。表2に各カクテルに含まれる阻害剤の一覧を示します。

実験結果

以下の実験データは、ホスファターゼ阻害剤カクテル1（カタログ番号P2850）と後継品の新しいホスファターゼ阻害剤カクテル3の阻害作用を比較しています。データから、2種類のカクテルの活性が同等であることが示されています。

さまざまなホスファターゼを阻害し、総ホスファターゼ活性を効果的に低下させるため、ホスファターゼ阻害剤カクテル2（カタログ番号P5726)およびホスファターゼ阻害剤カクテル3（カタログ番号P0044）の両方を使うことを特にお勧めします。

各種の細胞および組織抽出物における内因性PP1α様活性を、放射性基質32P-SerホスホリラーゼAを用いて、pH 7.5、30℃で測定しました。ホスファターゼ阻害剤カクテル1（カタログ番号P2850）またはホスファターゼ阻害剤カクテル3（カタログ番号P0044）を終濃度1％で抽出物に添加し、30℃で5分間反応後、PP1α様活性を測定しました。図1に示す活性は絶対値ではなく、相対値です。残存活性が低いほど、反応で用いたカクテルによる阻害効果が大きいことを意味します。

*これらの試料で観察された値は0に非常に近く、図では確認できません。

図1細胞・組織抽出物におけるPP1α様活性の阻害

プロテインホスファターゼ1α様活性の阻害

ホスファターゼ阻害剤カクテル3（カタログ番号P0044）は細胞や組織のプロテインホスファターゼ1α様活性を効果的に阻害します。以下の実験は、その阻害効果を示し、以前のホスファターゼ阻害剤カクテル1（カタログ番号P2850）と比較しています。

ヒト胎盤は、他の組織抽出物と比較して、タンパク質1 mgあたりのPP1α様活性が10～20倍高いです。そこで、ホスファターゼ阻害剤カクテルの阻害効率を示すためにヒト胎盤を選択しました。

ヒト胎盤抽出物中の内因性PP1α様活性を、放射性基質P-SerホスホリラーゼAを用いてpH 7.5、30℃で測定しました。ホスファターゼ阻害剤カクテル1（カタログ番号P2850）またはホスファターゼ阻害剤カクテル3（カタログ番号 P0044）を異なる量、抽出物に添加し、30℃で5分間反応後、PP1α様活性を測定しました。

pH10.4、37℃でpNPPを基質として用いた比色アッセイにより、ウシ肝臓抽出物中の内因性AP様活性を測定しました。ホスファターゼ阻害剤カクテル3（カタログ番号P0044）のみ、またはホスファターゼ阻害剤カクテル2（カタログ番号P5726）も一緒に抽出物に添加し、37℃で3分間の阻害反応後、AP様活性を測定しました。

アルカリホスファターゼ（AP）様活性の阻害

上述したとおり、異なるアルカリホスファターゼアイソザイムは異なる阻害剤で阻害されます。ホスファターゼ阻害剤カクテル3（カタログ番号P0044）はウシ肝臓抽出物中に存在するアルカリホスファターゼのL-アイソフォームを強力に阻害し、ホスファターゼ阻害剤カクテル2（カタログ番号P5726）と併用すると相乗効果を示します（図3A)。

ホスファターゼ阻害剤カクテル3（カタログ番号P0044）は、ヒト胎盤抽出物中に豊富に存在するアルカリホスファターゼ活性のP-アイソフォームの阻害にほとんど効果がないため、ホスファターゼ阻害剤カクテル2（カタログ番号P5726）で阻害します（図3B)。

図3A・Bウシ肝臓抽出物におけるアルカリホスファターゼ（AP）様活性の用量依存的な阻害