酵素活性アッセイ

研究者らが微生物、組織または試料中の特異的酵素の存在または量を特定するため、主に酵素活性アッセイが実施されています。このような酵素の例には、α-アミラーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、リゾチーム、およびアルカリホスファターゼやルシフェラーゼなどのレポーター酵素が含まれます。特異的な酵素基質反応を検討できるように、さまざまな試薬および方法論が広範に利用できます。適切なワークフロー溶液の選択は、各研究者が求める感度によって異なります。比色液は検出には有用ですが、蛍光ベースの試薬のほうが酵素活性の定量にはより適しています。   

酵素活性のための最適条件の決定

文献には数多くの酵素アッセイが記述されていますが、研究対象酵素の個別の要件に合わせてこれらの手順を変更する必要があります。酵素の比活性は、pH、温度、イオン強度、および試料中のあらゆる成分濃度など、数多くの因子に依存します。pHなどの条件では、酵素活性はほぼ正規分布曲線を示すことが多いです。特定pHでの最高活性はV_maxとして報告され、曲線の両末端で活性は低下します。酵素によっては、金属イオンや界面活性剤、そして疎水性分子など、反応と直接関係しない成分についても、さらに検討する必要があります。

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酵素アッセイの成分

多くの酵素では、細胞でみられる水ベースの環境と同じになるため、水が標準溶媒となります。しかし、酵素または酵素成分が水に不溶な場合は、有機溶媒が使用されます。さらにまた、基質および酵素反応を触媒する補酵素も、酵素活性アッセイの重要な成分です。基質および補酵素は、しばしば生理条件下でのそれらの機能に基づいて識別されます。そのため基質と補酵素は広範に相互作用するので、幅広くさまざまな酵素でこれらが必要となる可能性があります。緩衝液とイオンもアッセイを通したpHの安定化に不可欠で、酵素活性に直接影響するため、検討すべき追加の重要要素です。例えば、一価または二価の金属イオンが反応における触媒活性に必要となり、酵素活性に必要不可欠なことがあります。

酵素アッセイの実施

実際の最初のステップは、酵素アッセイの成分の調製です。一般に、ピペット操作で少量を扱う場合につきものの誤差を避けるため、1つの活性化成分を除いて、多量のアッセイ用混合液を調製するとよいです。このアッセイ用混合液を調製後、最後の活性化成分を添加して、活性アッセイを開始させます。アッセイ開始までの酵素の安定および最大活性を確保するため、冷却温度での酵素の保存、およびしばしば行われる各種化合物またはタンパク質添加物の追加など、酵素の前処理が重要な因子となります。反応材料を合わせて観察用容器に入れたら、反応を開始させるためすべての成分を迅速かつ徹底的に攪拌します。攪拌直後からデータ記録を開始し、全反応時間、アッセイからの検出シグナルをプロットします。