PCRマスターミックス

• PCRまたはRT-PCRマスターミックスとは
• マスターミックスの用途
• マスターミックスの成分
  
• マスターミックスのタイプ
• 一般的なPCRマスターミックスレシピ
• Standard PCRマスターミックス
  
• High-fidelity PCRマスターミックス
• RT-PCRマスターミックス
• qPCRマスターミックス
• 推奨PCRマスターミックス製品

PCR反応チューブ

PCRまたはRT-PCRマスターミックスとは

スーパーミックスまたはレディミックスとも呼ばれるPCRマスターミックスは、PCR試薬を最適な濃度で混合した液体であり、多数のPCRチューブまたは96ウェルPCRプレート間で分注することが可能です。マスターミックスには通常、DNAポリメラーゼ、dNTP、MgCl₂、バッファーが含まれています。マスターミックスには、ピペッティングの手間と汚染リスクの軽減、利便性、時間の節約、混合時に発生する可能性のあるエラーの回避などのメリットがあるため、ハイスループットの用途に最適です。 

研究者はマスターミックスを使用してコントロールを設定し、さまざまな濃度の標的DNAまたはRNAをテストできます。この際、正確な量の酵素、バッファー、補因子（通常はMgCl₂）、水、dNTPを反応チューブごとまたはプレートウェルごとに個別に添加する必要はなく、すべてまたは大半のPCR試薬を含んだ大量のマスターミックスを一度に調製します。適切な量のマスターミックスをピペットでチューブまたはプレートウェルに入れて、反応液間で異なるDNAテンプレートやRNAテンプレート、プライマーなどの成分と組み合わせることができます。

大規模なPCR反応には、1反応当たり25 µL～50 µL、2,000反応分以上の反応液が必要になる場合があります。20反応分からなる混合物の場合でも、研究者はマスターミックスによって時間を節約し、ピペッティングエラーを低減して、一貫性を向上させることができます。これらの混合物は、試薬が反応から完全に除外され、偽陰性の結果となることを回避します。

PCRマスターミックス計算ツールは、PCR反応のマスターミックスレシピを計画する際に役立ちます。

PCRマスターミックスの用途

PCRマスターミックスは、以下の用途で一般的に使用されます：

• ハイスループットPCR
• ルーチンPCR

ホットスタートDNAポリメラーゼを使用したマスターミックスは、以下の用途に最適です：

• マルチプレックスPCR
• プライマーダイマーの抑制
• 自動化に適した便利な室温でのセットアップ

予備調査段階の実験では、DNAテンプレートやRNAテンプレートを変更した場合でも、それ以外の成分をあらかじめ含んだマスターミックスを使用することが便利です。

PCRマスターミックスの成分

• 酵素
• バッファー
• 補因子 - 塩化マグネシウム（MgCl₂）が最も一般的です。MgSO₄が特定の酵素で使用されることがあります。
• dNTP
• プライマー
• テンプレートDNA（全サンプルが均一の場合）
  
• ヌクレアーゼフリーまたはPCRグレードの水

マスターミックスのタイプ

時間を節約し、測定と配分のエラーを回避するために、多くの既製のPCRマスターミックスが提供されています。

市販のPCRマスターミックスの大半は、ホットスタートなどの特定のタイプのPCR用に指定されているか、特定のサーマルサイクラーとのみ互換性があります。このことは、リアルタイムPCR（定量的PCRまたはqPCRとも呼ばれる）に特に当てはまります。リアルタイムPCRは、マスターミックス内の蛍光色素に対応するサーマルサイクラーで検出します。

市販のマスターミックスには、テンプレートDNAまたはRNAを添加するなど、使用前に調製が必要です。また、解凍、冷却、PCRグレード水での希釈、ピペットまたは遠心分離機を用いた混合が必要になる場合もあります。実験のニーズとPCRの手順に合わせて適切なマスターミックスを選択してください。

メルクは、さまざまな装置で検証済みのPCRおよびリアルタイムPCR用のマスターミックスを数多く提供しています。便利なPCR選択ガイドは、適切なマスターミックスまたは成分を特定し、独自のミックスを調製する際に役立ちます。ベストセラーのPCRマスターミックスは以下のPCRスタイル別に分類できます：

• Standard PCR
• High-Fidelity PCR
• RT PCR
• qPCR

一般的なPCRマスターミックスレシピ

PCRマスターミックスの基本レシピ。

容量	成分	最終濃度
5 µL	10X PCRバッファー	1X
1 µL	dNTP（10 mM）	200 µM
1～2 µL	フォワードプライマー	50～100 pmol
1～2 µL	リバースプライマー	50～100 pmol
0.5～1 µL	Taq DNAポリメラーゼ（5U/µL）	2.5～5 U
1～5 µL	テンプレートDNA	1～200 ng
1 µL	MgCl2（50 mM）	1 mM
適量	水	50 µLになるまで適量に添加
50 µL	合計容量

市販のマスターミックスの調製

この典型的なレシピは、ミックスごとに、また用途に応じて異なることにご注意ください。特定のマスターミックスまたはレディミックスの調製については、付属の製品資料をご確認ください。

容量	成分	終濃度
25 µL	2Xマスターミックス	1X
1 µL	フォワードプライマー	50 pmol
1 µL	リバースプライマー	50 pmol
1～5 µL	テンプレートDNA	1～200 ng
17～22 µL	水	50 µLになるまで適量に添加
50 µL	合計容量

標準的なPCRマスターミックス

ReadyMix™ Taq PCR反応ミックスとMgCl₂

ReadyMix™ Taq PCR反応ミックスは、PCR反応に必要なすべての試薬（特異的なプライマーとテンプレートを除く）を含めて調製された溶液です。この混合液には、メルクの高品質Taq DNAポリメラーゼ、純度99%のデオキシヌクレオチド、2x濃度のバッファーが含まれています。

Roche PCRマスター

Roche製のPCRマスターには、標準的なPCRに必要な試薬がすべて含まれています。加える必要があるのは、テンプレートDNAとプライマー、そして必要な量の水だけです。

REDTaq^® ReadyMix™ PCR反応ミックス

この混合物は、メルクのREDTaq^® DNAポリメラーゼのパフォーマンスと利点に加え、ReadyMix™ PCR反応ミックスの利便性を兼ね備えています。REDTaq^® ReadyMix™は、Taq DNAポリメラーゼ、純度99%のデオキシヌクレオチド、反応バッファー、および不活性赤色色素でできた、2x濃縮液です。

High-Fidelity PCRマスターミックス

Roche High-Fidelity PCRマスター

2倍濃度ですぐに使用できる便利な混合物、High-Fidelity PCRマスターをお選びください。拡張High-Fidelity PCRシステム、PCRグレードdNTP、MgCl₂、最適化された反応バッファーを混合した、すぐに使えるミックスです。

Millipore KODホットスタートマスターミックス

KODホットスタートDNAポリメラーゼ、2つのモノクローナル抗体、超高純度デオキシヌクレオチド、MgSO₄による反応バッファーを含んだ、すぐに使える2倍濃縮ミックスです。このミックスは、便利なハイフィディリティPCR用に最適化されています。

RT-PCRマスターミックス

Roche Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit は、他の逆転写酵素よりもフィデリティの高いRNA逆転写を行うように設計されています。このキットには、組み換え逆転写酵素と2段階RT-PCR用に最適化された校正媒介酵素のブレンドである、トランスクリプターハイフィデリティ逆転写酵素が含まれています。

SYBR^®グリーン定量的RT-qPCRキットによって、遺伝子発現の高感度な定量分析が可能になります。メルクのQRT-PCR ReadyMix™は、M-MLV RTとJumpStart Taqの利点を兼ね備えた便利なレディミックスです。

KiCqStart^® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ 試薬は、ハイブリダイゼーションプローブ検出ケミストリーを使用した、RNAテンプレートの逆転写定量的PCR（RT-qPCR）用のすぐに使える高感度マスターミックスです。ハイブリダイゼーションプローブの例には、リアルタイムPCRシステムのTaqMan^® 5'-加水分解プローブなどがあります（お使いの装置に適した試薬を選択するには、装置の互換性に関するセクションをご参照ください）。

MystiCq^® microRNA cDNA合成ミックスには、mature microRNAをqPCR用のcDNAテンプレートに変換するのに必要な成分がすべて含まれています。このキットを使えば、ポリアデニル化と逆転写ステップを必要に応じて別々に行うことによって、プロトコルを最適化できる可能性があります。

リアルタイムqPCRマスターミックス

プローブベースのqPCR

RocheのFastStart TaqMan®プローブマスターは、そのまま使用可能な2倍濃縮マスターミックスであり、qPCRおよび2ステップqRT-PCRを含む、加水分解プローブ検出形式で行う定量的なリアルタイムDNA検出アッセイを実行するのに必要なすべての試薬（プライマー、プローブ、テンプレートを除く）が含まれています。

Roche EagleTaqユニバーサルマスターミックス（ROX）は、定量的でリアルタイムのPCR加水分解プローブ反応を実行するために必要なすべての試薬（プライマー、プローブ、テンプレートを除く）を含んだ、すぐに使用できる2倍濃縮PCRマスターミックスです。特殊なROXリファレンス色素を含んでいるため、定量分析にROXリファレンス色素を必要とするすべてのリアルタイム装置に適しています。

SYBR^®グリーンPCR

SYBR^®グリーンマスターミックスは、リアルタイムPCRに適しています。非対称シアニン色素を採用しています。メルクで最も人気のあるSYBR^®グリーンミックスは、RocheのFastStart SYBR^®グリーンです。FastStart SYBR^®グリーンマスターは、qPCRおよび2段階qRT-PCR用の反応用調製物の準備を簡略化する、すぐに使用できる試薬混合物であり、DNAの検出および分析用のインターカレート色素であるSYBR^®グリーンIを使用しています。

KiCqStart^® qPCR ReadyMix™ 試薬

KiCqStart^® qPCR ReadyMix™ マスターミックスは、すぐに使える濃縮形式で提供されており、バッファー、安定化剤、およびホットスタートTaqを含んでいます。任意のサーマルサイクラーの高速サイクルプロトコルまたは従来のサイクルプロトコルで使用できます。SYBR^®グリーンベースまたはプローブベースのミックスから選択できます。

KiCqStart^® SYBR^®グリーンqPCR ReadyMix™マスターミックスは、Bio-Rad、Cepheid、Eppendorf、Illumina、Corbett、Rocheの各システムと互換性があります。ミックスには、最適化された濃度のMgCl₂、dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、KiCqStart^® Taq DNAポリメラーゼ、SYBR^®グリーン色素、安定化剤からなる2倍濃縮の反応バッファーが含まれます。

Low ROX™は、ABIおよびStratagene装置用のLow ROX™と連携します。

LuminoCt™ qPCR試薬

高度に最適化されたReadyMix™ケミストリーに基づくLuminoCt™ qPCR試薬は、正確さや精度、感度を犠牲にすることなく、卓越したアッセイ速度を実現します。そして何よりも、LuminoCt™試薬はほとんどのqPCR装置とシームレスに連携するため、反応条件の最適化が最小限に抑えられます。多くの場合、キットを選択してアッセイを構築するだけで、すぐに作業を開始できます。実現しうる最高品質のqPCRデータを、かつてないほどすばやく簡単に生成できるようになりました。

LuminoCt™ SYBR^®グリーンqPCR ReadyMix™試薬は、正確さや精度、感度を犠牲にすることなく、卓越したアッセイ速度を実現するようにデザインされています。ReadyMix™ケミストリーの徹底したデザインと検証により、適切にデザインされたプライマーとLuminoCt™試薬を併用する場合の最適化の必要性が事実上なくなりました。ReadyMix™試薬にJumpStart™ Taq抗体をあわせて使うと、化学的に修飾されたホットスタートTaqに関連するパフォーマンスの問題を引き起こすことなく、室温でのポリメラーゼ活性を阻害できます。

LuminoCt™ qPCR ReadyMix™キットは、一般に入手可能なリアルタイム装置プラットフォーム上でプローブベースのqPCRアッセイを実施するようデザインされています。qPCRアッセイのノーマライゼーションにROXパッシブリファレンス色素を必要とするリアルタイム装置でReadyMix™試薬を使用する場合は、リファレンス色素（キットに同梱）の添加が必要になります。

推奨マスターミックス製品