Locked Nucleic Acid

米国を除くすべての国で、qPCRプローブ以外のオリゴヌクレオチドにLocked Nucleic Acid（LNA）をご利用できます。

LNAは、2'-O, 4'-Cメチレンで架橋した新しいタイプの人工核酸です（図1）。この、3'-endoコンフォメーションの固定によって、リボフラノース環の柔軟性が制限され、非常に強固な二重らせん構造となります。これによって分析性能が高まり、用途の幅が広がります。 

図1. LNAモノマーとDNAモノマーの構造

PCRプライマー、qPCRプローブやその他の種類のオリゴヌクレオチド内のLNAは、水と標準的緩衝液に可溶性であり、ワトソン・クリックの塩基対形成の法則に従います¹。

利点

LNAがオリゴヌクレオチドに組み込まれた場合には、DNA塩基のみの場合と比較して、次のようないくつかの利点があります：

• ・熱安定性とハイブリダイゼーション特異性が高まります
• ・遺伝子定量と対立遺伝子識別の正確性が高まります
• ・困難なターゲットシーケンスに対して、より容易で柔軟に設計を行うことができます

熱安定性およびハイブリダイゼーション特異性の向上

LNAをオリゴヌクレオチドに組み込むと、二本鎖の熱安定性が高まり²、オリゴヌクレオチドの標的配列へのハイブリダイゼーションの特異性が向上します³。qPCRの場合は、これによってターゲット以外の配列への結合によるバックグラウンド蛍光が減少し、シグナル／ノイズ比（S/N比）が高まります。さらに、PCRプライマーまたはqPCRプローブの標的へのハイブリダイゼーションの向上によって、DNAオリゴヌクレオチドと比較して、融解温度（T_m）が、中間塩状態でのLNAモノマー置換あたり最大8℃上昇する可能性があります⁴（表1）。ハイブリダイゼーションにおけるこの向上によって、分析条件の範囲が大幅に広がり、より効果的なマルチプレックス解析が可能になります⁵。

表1 オリゴヌクレオチド内のLNA塩基数が増えるとT_mが上昇します。

配列	LNA数	Tm*	ΔTm	ΔTm/LNA
GTGATATGC	0	29℃		—
GTGATATGC	3	44℃	15℃	+5℃
GTGATATGC	9	64℃	35℃	+3.9℃

*オリゴヌクレオチドとその相補配列との二本鎖のT_m。
配列内の太字はLNA塩基を示します。

遺伝子定量および対立遺伝子識別の正確性の向上

SNPを介して対立遺伝子を識別するオリゴヌクレオチドの能力は、LNA塩基の組込みによって大幅に向上します^6-8（図2）。単一塩基ミスマッチの存在は、DNAオリゴヌクレオチドとその標的よりも、LNAオリゴヌクレオチドとその標的の間の二本鎖形成により大きな不安定化作用を及ぼします。LNA塩基を組み込んだ比較的短いオリゴヌクレオチドは、より長いDNAオリゴヌクレオチドと同じ温度で使用することができます。

図2. SNPジェノタイピング解析において、LNA両末端標識プローブはDNA両末端標識プローブより高い識別能を示します9。ピンク）LNA変異プローブ（LNA塩基3個を含む16mer）による変異DNA解析。緑）DNA変異プローブ（25mer）による変異DNA解析。赤）DNA変異プローブ（25mer）による野生型DNA。紫）LNA変異プローブ（LNA塩基3個を含む16mer）による野生型DNA。

困難なターゲットシーケンスのためのより簡単でフレキシブルなデザイン

LNAはハイブリダイゼーション特性が向上し、それに伴いT_mが上昇していることから、LNAオリゴヌクレオチドは比較的短く合成することが可能であり、それによって、DNAオリゴヌクレオチドで生じる特定の設計上の問題が克服されます。特に、LNAオリゴヌクレオチドは、ATまたはGCリッチ領域などの、従来は困難であった標的配列に対応するように設計することができます。例えば、ATリッチな天然状態のDNAオリゴヌクレオチドは、多くの場合、アンプリコン設計ガイドラインを満たすためには長さが30塩基以上である（場合によっては40塩基以上）必要がありますが、それでも性能が不十分なことがあります。LNAオリゴヌクレオチドでは、LNA塩基の選択的配置によって、わずか13～20塩基の長さでも十分な性能を発揮する、特異性が高く、短いオリゴヌクレオチドの設計が容易になります。また、比較的安定なG：Tミスマッチなどの、困難なSNPを標的とするオリゴヌクレオチドの設計も容易になります。 

さらなる利点

LNA PCRプライマーおよびqPCRプローブは、すべてのリアルタイムPCRやエンドポイントPCRに適合しています。専用の装置は必要ありません。

アプリケーション

LNAは、下記を含む、利用可能なすべてのqPCR検出ケミストリーに組み込むことができます：

• ・SYBR^®Greenプライマー
• ・両末端標識プローブ
• ・モレキュラービーコン
• ・LightCycler^®プローブ（日本国内取扱いなし）
• ・Scorpions^®プローブ

下記に有用です：

• ・SNP検出
• ・対立遺伝子の識別
• ・病原体検出
• ・マルチプレックス
• ・ウイルス量の定量化
• ・遺伝子発現解析
• ・遺伝子コピー決定

以下の配列にも使用できます：

• ・アンチセンスオリゴヌクレオチド
• ・デコイオリゴヌクレオチド
• ・キャプチャープローブ
• ・アプタマー
• ・リボザイム

1. Egli M, Teplova M, Minasov G, Kumar R, Wengel J. 2001. X-ray crystal structure of a locked nucleic acid (LNA) duplex composed of a palindromic 10-mer DNA strand containing one LNA thymine monomer.. Chem. Commun..(7):651-652. https://doi.org/10.1039/b009447l

2. Braasch DA, Jensen S, Liu Y, Kaur K, Arar K, White MA, Corey DR. 2003. RNA Interference in Mammalian Cells by Chemically-Modified RNA?. Biochemistry. 42(26):7967-7975. https://doi.org/10.1021/bi0343774

3. Latorra D, Arar K, Michael Hurley J. 2003. Design considerations and effects of LNA in PCR primers.. Molecular and Cellular Probes. 17(5):253-259. https://doi.org/10.1016/s0890-8508(03)00062-8

4. CHRISTENSEN U, JACOBSEN N, RAJWANSHI VK, WENGEL J, KOCH T. 2001. Stopped-flow kinetics of locked nucleic acid (LNA)?oligonucleotide duplex formation: studies of LNA?DNA and DNA?DNA interactions. 354(3):481-484. https://doi.org/10.1042/bj3540481

5. Latorra D, Hopkins D, Campbell K, Hurley JM. 2003. Multiplex Allele-Specific PCR with Optimized Locked Nucleic Acid Primers. BioTechniques. 34(6):1150-1158. https://doi.org/10.2144/03346bm06

6. Latorra D, Campbell K, Wolter A, Hurley JM. 2003. Enhanced allele-specific PCR discrimination in SNP genotyping using 3’ locked nucleic acid (LNA) primers.. Hum.Mutat.. 22(1):79-85. https://doi.org/10.1002/humu.10228

7. Mouritzen P, Nielsen AT, Pfundheller HM, Choleva Y, Kongsbak L, Møller S. 2003. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA?). Expert Review of Molecular Diagnostics. 3(1):27-38. https://doi.org/10.1586/14737159.3.1.27

8. Simeonov A. 2002. Single nucleotide polymorphism genotyping using short, fluorescently labeled locked nucleic acid (LNA) probes and fluorescence polarization detection.. 30(17):91e-91. https://doi.org/10.1093/nar/gnf090

9. Ugozzoli LA, Latorra D, Pucket R, Arar K, Hamby K. 2004. Real-time genotyping with oligonucleotide probes containing locked nucleic acids.. Analytical Biochemistry. 324(1):143-152. https://doi.org/10.1016/j.ab.2003.09.003