MISSION® ;shRNAのご紹介
shRNAを選ぶ理由
コントロールを使う
大腸菌グリセロールストックのご紹介
精製プラスミドDNAのご紹介
レンチウイルス粒子（パーティクル）のご紹介
初回ご注文時
RNAi用語集
サポートが必要な場合
shRNAを選ぶ理由
RNA干渉を用いた遺伝子サイレンシングおよびノックダウンはとても一般的になりつつあります。低分子干渉RNA（siRNA）の培養細胞への導入は、迅速かつ効率的に遺伝子発現をノックダウンする手段であるため、今やsiRNAは分子生物学分野の汎用ツールとなっています。siRNAがある種の形質転換された哺乳類細胞株において短期的な遺伝子抑制の効果が示されているのに対し、ショートヘアピンRNA（shRNA）は強力かつ安定的に遺伝子発現を抑制します。
長期で安定的な遺伝子サイレンシングが、shRNAコンストラクトと他のRNAiツールとの明確な違いです。ターンオーバーが遅い（と考えられる）遺伝子の場合、長期的なサイレンシングにshRNAを用いることは便利なだけではなく、唯一の選択肢です。このようなタンパク質では、mRNAの効率的な分解より先にsiRNAが減少しているかもしれません。長期的な遺伝子サイレンシングは、pLKO.1プラスミドとピューロマイシンを用いる標準的なクローン選択方法により達成できます。MISSION®バイオプロダクションチームは、クローンの選択やshRNA MISSION® TRC（TRCとは何か？）のレンチウイルスによる導入よりはるかに有効でバイアスの少ないソリューションを提供します。shRNAレンチウイルスコンストラクトは初代細胞や非分裂細胞などの難しい細胞株でも容易に遺伝子導入ができ、導入されたshRNAが宿主細胞のゲノムに組み込まれることで、安定的な遺伝子サイレンシングを実現します。
標的遺伝子用shRNAの詳細ページに記載されているクローンセット数（製品によって異なりますが通常は5クローンです）を購入した場合、1遺伝子につき1クローン以上について70%超のノックダウンレベルを保証します。
メルクの研究開発チームおよび外部調査機関のアプリケーションデータをご覧ください。
MISSION® TRCライブラリを用いている参考文献 をご覧ください。
コントロールを使う
MISSION® TRC shRNAコンストラクトを用いて実験を行うとき、適切なコントロールを選ぶことが、ノックダウンの結果を正確に解釈するための重要な要素です。どのコントロールも精製プラスミドDNA、レンチウイルス粒子のどちらのフォーマットでも利用できます。
さらに、ある細胞株を初めて使う場合、導入効率の最適化にMISSION® TurboGFP™コントロール形質導入パーティクル（SHC003V）を利用できます。
あらゆるshRNA実験にお勧めのコントロールを、shRNAコントロールのウェブページに掲載しています。これらは、Nature Cell Biologyの論説で提唱されているコントロールに準拠しています。1
参考文献：
大腸菌グリセロールストックのご紹介
MISSION® TRC shRNA大腸菌グリセロールストックから何度でもshRNAコンストラクトを作成できます。ベクターをそのまま一時的または安定的なトランスフェクションに使ったり、パッケージングプラスミドとともにレンチウイルス粒子の作成に使ったりすることができます。
ベクターマップのページをご覧ください。
精製プラスミドDNAのご紹介
MISSION® TRC shRNA により精製したプラスミド DNA フォーマットは、各コンストラクトからの DNA 調製の手間を省きます。DNAをそのまま一時的または安定的なトランスフェクションに使用したり、パッケージング細胞株でパッケージングプラスミドとともに使用しレンチウイルス粒子を作成したりすることができます。各コンストラクトにDNA 1 µgが含まれています。
ベクターマップのページをご覧ください。
MISSION® shRNAプラスミドDNA技術情報 （PDF）
MISSION® TRC shRNA精製プラスミドDNAコンストラクトは、市販されているトランスフェクション試薬の大半に適合します。細胞株のなかには、トランスフェクションに対する感度／抵抗性がより強いものもあります。導入効率をMISSION® TurboGFPコントロールベクター（SHC003）で最適化することも可能です。
メルクはさまざまな細胞種に合ったトランスフェクション試薬を提供しています。
レンチウイルス粒子（パーティクル）のご紹介
MISSION® TRC shRNAレンチウイルス粒子フォーマットは、徹底的に使いやすいよう設計されています。本製品は、細胞に直接添加できます。初代細胞や非分裂細胞を含め、ほぼすべての哺乳類細胞株の形質導入が可能です。
MISSION® shRNA レンチウイルス粒子技術情報（PDF）
細胞株の選択
MISSION® TRCレンチウイルス粒子はVSV-Gエンベロープタンパク質で偽ウイルス粒子にしたものです。これにより、shRNAを内包したレンチウイルス粒子をさまざまな哺乳類細胞株に効率的に導入できます。ある細胞株を初めて扱う場合、MISSION® TurboGFPコントロール形質導入粒子（SHC003V）を用いて導入に必要なレンチウイルス量を決定することをお勧めします。この重要な陽性コントロールはTurboGFPという緑色の蛍光タンパク質マーカーを発現するため、実験系のモニタリングや結果の解釈に利用できます。ExpressMag® 形質導入システムを使えば、導入効率をさらに高めることができます。本システムはナノ粒子と強力なレアアースマグネットを使用し、レンチウイルス導入効率を高めます。
レンチウイルス形質導入について細胞株を検証しましたか？
アッセイの選択
標的遺伝子の発現やノックダウンの評価のために実施するアッセイ法をまず決めます。さまざまなアッセイ法を利用してmRNAレベル、タンパク質レベル、または表現型応答を明らかにすることができます。アッセイ法を決める際は、必須遺伝子をノックダウンすると、宿主細胞が死滅する可能性があり、アッセイによっては影響を及ぼすことがあることを念頭に入れてください。
タンパク質アッセイ
ウェスタンブロッティング
表現型アッセイ
がんマーカー
細胞生死および増殖
細胞シグナリング
多重感染度（MOI）
多重感染度とは、1細胞に感染するレンチウイルス粒子の数です。新しい細胞種に形質導入をしたい場合は、その度にMOIのレンジを決めることを強くお勧めします。MOIは1ウェル当たりの細胞数や、ウェルへのレンチウイルス上清添加量の増減によって調整することができます。これにより、各使用細胞株への効率的な導入に必要なレンチウイルス上清の適量を決定します。MOI 0.5、MOI 1、MOI 2、MOI 5の量を決めることを推奨しています。
計算式は以下のとおりです：
（1ウェル中の総細胞数）×（目標MOI）＝必要な総導入単位（TU）
（必要な総TU）／（試験成績書に記載のTU/mL）＝各ウェルに添加するレンチウイルス粒子量（mL）
ピューロマイシン滴定（選択に使用時）
新しい細胞種を扱うときは、ピューロマイシン滴定（死滅曲線）を行ってください。
- 新鮮な培地120 µLを添加した96ウェルプレートの各ウェルに細胞1.6 × 104個を播種します。
- 翌日、ピューロマイシン500～10,000 ng/mLをそれぞれのウェルに添加します。
- 2日ごとに生細胞数を測定します。
- 10～14日間培養します。ピューロマイシン含有培地を3日ごとに交換します。
- 3～5日後に全細胞を死滅させるピューロマイシンの最小濃度をその細胞種に適用します。
プロトコルページにて有用なshRNAプロトコルの一覧を公開しています。
初回ご注文時
MISSION® TRC shRNAライブラリはオンライン注文が可能です（日本国内のお客様はメルク販売店にご注文ください）。まずお客様のオンラインプロフィールに入力し、「オンライン注文へのアクセス」のボックスにチェックを入れてください。プロフィールの登録が完了すると、ご希望のクローンをカートに追加できます。
サポートが必要な場合
サポートが必要な場合はmissionrnai@milliporesigma.comまでご連絡ください。
お問い合わせ先
ライブラリ、価格、見積り、その他の点については、Eメール（missionrnai@milliporesigma.com）までお問い合わせください。
MISSIONはMerck KGaA（ドイツ・ダルムシュタット）およびその関連会社の登録商標です。その他の商標は各所有者に所有権があります。商標に関する詳細情報は、一般公開されている資料で閲覧できます。ラベルライセンス
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