細菌形質転換プロトコル

形質転換は分子クローニングの重要なプロセスであり、これにより遺伝子組換えDNA分子の複数コピーが産生されます。遊離した細胞外の遺伝物質の取込み能は、形質転換を行う細菌コンピテントセルには必須です。目的は、遺伝子組換えプラスミドの対象配列の複製物を得ることです。

図1. 形質転換

形質転換を開始する前に：

• LBアガープレートを準備し、セットできるようにしておきます。成型済みプレートを使用する場合、プレートが37℃に保温されていることを確認します。
• プラスミドDNAに存在する抗生物質耐性マーカーに応じて、LBアガーに適切な抗生物質を混合します。
• 遺伝子組換えのblue/white screeningが必要な場合、1 mM IPTG、300 μg/mL S-Galまたは40 μg/mL X-Galおよび500 μg/mLクエン酸鉄アンモニウムをLBアガーと混合します。
• エレクトロコンピテントセルを使用する場合、エレクトロポレーションチャンバーを氷上に静置します。
• 水浴を37℃に加熱します。
• 滅菌SOC培地を室温に保温します（または水浴で20～25℃）。

化学的コンピテントセルを用いた形質転換のためのプロトコル

準備する必要のある物：

試薬	装置
SOC培地（製品番号S1797）	シェーカーインキュベーター（37℃）
LBアガーEZMix™（製品番号L7533）	キャビネット型インキュベーター（37℃）
適切に選択された抗生物質	保温した水浴（37℃）
IPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクトシド） （製品番号I6758）	15 mLポリプロピレン製培養チューブ（滅菌）
X-gal（製品番号B9146）	培養皿
S-Gal™（製品番号S9811）	Lazy-L滅菌スプレッダー（製品番号Z376779）
クエン酸鉄アンモニウム（製品番号F5879）

標準の形質転換プロトコル

1. 必要数のチューブを－70℃フリーザーから氷中に移します。必要に応じ、コントロールDNA用のチューブを追加します。
2. 細胞を5分間解凍します。チューブを複数回軽くタッピングし、均一な懸濁液を作ります。
   1. コントロール：1 μL (10 ng) pUC19コントロールDNAをチューブ1本に添加します。軽くタッピングして混和し、氷上に静置します。
   2. 1～50 ng精製プラスミドDNAを直接チューブの残りの細胞に添加します。軽くタッピングして混和し、氷上に静置します。
3. 氷上で30分、細胞をインキュベートします。
4. 37℃の水浴に正確に45秒、細胞を移します。
5. 氷中に2分、細胞を移します。
6. SOC培地を各チューブに添加します。細胞を滅菌ポリプロピレン製チューブに移し、培養物のエアレーション促進のためキャップを緩めます。
7. シェーカーインキュベーター（225～250 rpm）を用いて、37℃で1時間、細胞をインキュベートします。
8. 選択した抗生物質を添加したLBアガープレート上に形質転換した各細胞懸濁液10～100 μLをピペットで添加し、滅菌スプレッダーで塗り広げます。
9. 37℃で終夜、プレートをインキュベートします。
10. コロニーを選択し、必要に応じ培養します。
11. 各培養物からプラスミドDNAを単離します。
12. 選択したクローンを培養します。
13. 制限酵素を用いてプラスミドDNAを消化し、ゲル電気泳動により分離します。

エレクトロコンピテントセルを用いた形質転換のためのプロトコル

準備する必要のある物：

試薬	装置
SOC培地（製品番号S1797）	シェーカーインキュベーター（37℃）
LBアガーEZMix™（製品番号L7533）	キャビネット型インキュベーター（37℃）
適切に選択された抗生物質	保温した水浴（37℃）
IPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクトシド） （製品番号I6758）	15 mLポリプロピレン製培養チューブ（滅菌）
X-gal（製品番号B9146）	培養皿
S-Gal™（製品番号S9811）	Lazy-L滅菌スプレッダー（製品番号Z376779）
クエン酸鉄アンモニウム（製品番号F5879）	培養皿

標準の形質転換プロトコル

1. 必要数のチューブを－70℃フリーザーから氷中に移します。必要に応じ、コントロールDNA用のチューブを追加します。
2. 細胞を5分間解凍します。チューブを複数回軽くタップし、均一な懸濁液を作ります。
3. 形質転換反応ごとに1つずつ、SOC培地を培養チューブに移し、室温下で静置します。
   
   （SOC培地の容量は、次の工程で添加する細胞の容量に応じて変動します。コンピテントセルおよびSOC培地の最終容量は1,000 μLになります）
4. 形質転換反応ごとに1つずつ、1 mmの標準キュベットおよび滅菌のマイクロチューブを氷上に静置します。
5. コンピテントセルを氷冷したマイクロチューブに移します。80 μLのパッケージから細胞40 μL、100 μLのパッケージから細胞50 μLを使用します。
   1. コントロール：1～5倍希釈したpUC19コントロールDNA 1 μLをチューブ1本に添加します。
   2. 1～5倍希釈したDNAまたはライゲーションミックスのTEバッファー溶液を調製します。マイクロチューブに添加します。
6. DNAおよび細胞混合物を氷冷した1 mmキュベットにピペットで移します。
7. エレクトロポレーターを電界強度25 kV/cm、6分にセットし、細胞処理を行います。
8. キュベットから細胞を除去し、SOC培地を含むチューブに添加します。
9. シェーカーインキュベーター（225～250 rpm）を用いて、37℃で1時間、細胞をインキュベートします。
10. 選択した抗生物質を添加したLBアガープレート上に形質転換した各細胞懸濁液10～100 μLをピペットで添加し、滅菌スプレッダーで塗り広げます。
11. 37℃で終夜、プレートをインキュベートします。
12. コロニーを選択し、必要に応じ培養します。
13. 各培養物からプラスミドDNAを単離します。
14. 制限酵素を用いてプラスミドDNAを消化し、ゲル電気泳動により分離します。
15. 選択したクローンを培養します。

形質転換プロセスを最適化するための重要なコツ：

• 受領時に細胞がまだ凍結していること・ドライアイスがまだ存在していることを確認します。
• 最大の形質転換効率を得るため、フェノール・エタノール・タンパク質・塩類・界面活性剤フリーである、高品質のDNAサンプルを使用します。エレクトロコンピテントセルを使用する場合、DNA中に大量の塩類が含まれていると高電圧でのアーク放電をもたらすため、サンプル・装置を損傷することがあります。
• 高品質の試薬からなるライゲーション反応液中のDNAは、形質転換に使用できます。DNAリガーゼを不活化する必要はありません。
• コンピテントセルは常に氷冷します。細胞が偶発的に保温されないようにします。
• チューブを軽くタップし、均一な細胞懸濁液を作ります。ボルテックスまたはピペットを使って混和しないでください。
• 最適なコロニー生育のため、LBアガープレートを37℃まで保温します。
• エレクトロコンピテントセルを用いた、形質転換のためのエレクトロポレーターの設定：
  • BTX Model ECM 630：HVモード、2.5 kV、25 μF、100 Ω、1 mmキュベット
  • BioRad Gene Pulser：2.5 kV、25 μF、100 Ω、1 mmキュベット

参考文献

1. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual.. New York: Cold Spring Harbor Larboratory Press.

2. Dubnau D. 1999. DNA Uptake in Bacteria. Annu.Rev. Microbiol.. 53(1):217-244. https://doi.org/10.1146/annurev.micro.53.1.217

3. Lorenz MG, Wackernagel W. 1994. Bacterial gene transfer by natural genetic transformation in the environment.. 58(3):563-602. https://doi.org/10.1128/mmbr.58.3.563-602.1994