低分子CRISPRエンハンサー

低分子CRISPRゲノム編集効率を向上させる低分子エンハンサー

ゲノム編集ツールとしてCRISPR／Cas9システムの人気が高まるにつれ、CRISPR遺伝子編集の正確性の改善を求める声が増えています。CRISPR／Cas9ゲノム編集の全体的効率を高め、より正確なターゲティングを可能にする生理活性低分子が数々の研究で特定されています。私たちはCRISPRベースのツールを世界中の研究者に届けており、加えてこうした低分子化合物を多数提供しています。

CRISPR／Cas9システムはRNA誘導型ゲノム編集ツールであり、さまざまな生物のゲノムをシンプルかつ簡便、迅速に修飾することを可能にしました。このシステムを使うと、Cas9が標的配列に誘導され、DNAを開裂し二本鎖DNAを切断します（DSB）。細胞は、非相同末端結合（non-homologous end joining: NHEJ）または相同組換え修復（homology-directed repair: HDR）のいずれかの方法で切断を修復します。通常、細胞はNHEJによる修復を行い、Cas9を介したゲノム編集の多くにもNHEJが見られます。しかし、NHEJは正確な修復ではなく、塩基の挿入または欠失（INDELS）が生じ、予測不能な結果につながります。多くの研究者たちは、標的DNA配列（SNPs、ノックイン遺伝子、条件付きノックアウト等）の修飾だけをコントロールできるような、より正確なターゲッティングを望んでいます。こうした場合、DNA鋳型を用いたHDRが修復機構として好ましいのですが、NHEJと比べると細胞がこの経路を使う頻度は多くありません。Cas9によるゲノム編集の効率アップや、NHEJ／HDRによるDNA修復経路を調節可能な低分子を特定するための研究が多数行われています。

CRISPRゲノム編集におけるHDR制御については多数の研究グループが調査しており、さまざまな細胞種でCRISPRによるHDRの効率を高める低分子が特定されています。こうした化合物は細胞種特異的、またコンテキスト依存的で、その活性度はさまざまであることがわかっています。化合物RS-1（RAD51-stimulatory compound 1）はヒト相同組換え（homologous recombination: HR）タンパク質RAD51の惹起物質として知られ、RAD51のDNA結合および組換え活性を特異的に誘導します。Songらはウサギ胚を使ったin vitroおよびin vivo試験において、RS-1がRAD51活性を誘導する可能性があること、その結果RS-1がCas9介在型ノックインの効率を高めることを示しました。またPinderらは、ヒト胚腎臓HEK293A細胞をRS-1で処理することで、Cas9によるHDRが増加することを示しました。Pinderらは、β3アドレナリン受容体の強力なパーシャルアゴニストであるL755507についても調べました。この結果からは、HEK293A細胞ではHDRがわずかに誘導されただけでしたが、Yuらはその後、ヒトiPS細胞（iPSCs）でL755507がCRISPRによるHDRを亢進することを実証しました。HDRを促進するには、NHEJを減少させるのもひとつの手です。SrivastavaらがNHEJ阻害剤として報告したSCR7は、Maruyamaらによってヒトおよびマウスの培養細胞でHDRを介したCRISPR／Cas9ゲノム編集の効率を上げることが示されました。この論文発表後、当初発表されたSCR7の構造とCRISPR関連研究で使われた実物の構造に不一致が発見されています。効率アップを実際にもたらした化合物は、SCR7が自然に環状になったSCR7ピラジンであることが示されました。SCR7ピラジンを用いたその後の研究により、この化合物がCRISPR／Cas9ゲノム編集の効率に及ぼす影響は細胞種特異的で、コンテキスト依存的であることが示されました。上記のほかに、ほかの低分子についてもCRISPR編集効率の制御に関する研究が行われています。詳細は下記をご覧ください。

参考文献

1. Lin S, Staahl BT, Alla RK, Doudna JA. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. 3 https://doi.org/10.7554/elife.04766

2. Pinder J, Salsman J, Dellaire G. 2015. Nuclear domain ‘knock-in’ screen for the evaluation and identification of small molecule enhancers of CRISPR-based genome editing. Nucleic Acids Res. 43(19):9379-9392. https://doi.org/10.1093/nar/gkv993

3. Ma Y, Chen W, Zhang X, Yu L, Dong W, Pan S, Gao S, Huang X, Zhang L. 2016. Increasing the efficiency of CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing in rats by inhibiting NHEJ and using Cas9 protein. RNA Biology. 13(7):605-612. https://doi.org/10.1080/15476286.2016.1185591

4. Yang D, Scavuzzo MA, Chmielowiec J, Sharp R, Bajic A, Borowiak M. 2016. Enrichment of G2/M cell cycle phase in human pluripotent stem cells enhances HDR-mediated gene repair with customizable endonucleases. Sci Rep. 6(1): https://doi.org/10.1038/srep21264

5. Song J, Yang D, Xu J, Zhu T, Chen YE, Zhang J. 2016. RS-1 enhances CRISPR/Cas9- and TALEN-mediated knock-in efficiency. Nat Commun. 7(1): https://doi.org/10.1038/ncomms10548

6. Davis KM, Pattanayak V, Thompson DB, Zuris JA, Liu DR. 2015. Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity. Nat Chem Biol. 11(5):316-318. https://doi.org/10.1038/nchembio.1793

7. Chu VT, Weber T, Wefers B, Wurst W, Sander S, Rajewsky K, Kühn R. 2015. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. 33(5):543-548. https://doi.org/10.1038/nbt.3198

8. Maruyama T, Dougan SK, Truttmann MC, Bilate AM, Ingram JR, Ploegh HL. 2015. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nat Biotechnol. 33(5):538-542. https://doi.org/10.1038/nbt.3190

9. Yu C, Liu Y, Ma T, Liu K, Xu S, Zhang Y, Liu H, La Russa M, Xie M, Ding S, et al. 2015. Small Molecules Enhance CRISPR Genome Editing in Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 16(2):142-147. https://doi.org/10.1016/j.stem.2015.01.003