ホーム細胞シグナル伝達組織分散ガイド：コラゲナーゼ、ディスパーゼ、およびリベラーゼ酵素種

組織分散ガイド：コラゲナーゼ、ディスパーゼ、およびリベラーゼ酵素種

メルクの組織分散酵素に関する一般情報

メルクのコラゲナーゼ酵素の概要
コラゲナーゼ酵素製品
Roche社のコラゲナーゼ・Liberase^®酵素
コラゲナーゼアッセイ
コラゲナーゼによる組織の分解／分散のトラブルシューティング・参考文献
参考文献

動物組織を接着する天然コラーゲンを分解する酵素であるコラゲナーゼは、さまざまな微生物や多様な動物細胞によって生成されています¹。最も強力なコラゲナーゼは、嫌気性細菌Clostridium histolyticumが分泌する「未精製」コラゲナーゼです。私たちは当初、MacLennan、Mandl、Howes²が報告した1953年の発酵・精製プロセスを採用しましたが、最終的には、より活性の高い製品を得るために改良を加えました。「未精製」コラゲナーゼとは、組織を分解するために共に作用する数種類の酵素とコラゲナーゼの混合物であるという事実を指しています。現在、コラゲナーゼ酵素には2種類の型が存在することが知られています^3,4。いくつかの例外を除いて、さまざまな市販のコラゲナーゼはすべてC. histolyticumから作製されたものであるか、あるいはC. histolyticumからクローニングされた遺伝子を大腸菌が発現する組換え型です。

メルクのコラゲナーゼ酵素の概要

以下の表に示すさまざまなコラゲナーゼ製品は、それぞれある種の組織（筋肉、膵臓、心臓、脂肪）を他の組織よりもよく消化することから開発されたものです。私たちのコラゲナーゼ製品のすべてのロットは、酵素活性規格を満たすだけでなく、さまざまなラット組織を用いた消化試験に合格しなければなりません。「細胞培養試験済み」とも記載されている製品については、細胞毒性を示さないことを確認するための、哺乳類細胞株を用いた追加試験が実施されています。

より一般的なコラゲナーゼ製品の一部から調製されたろ過滅菌（0.2 mm）製品も以下にあげています。

私たちの精製コラゲナーゼ製品のカゼイナーゼ（タンパク質分解）活性またはクロストリパイン活性の量はごくわずかです。また、精製VII型コラゲナーゼは細胞培養試験済みタイプとろ過滅菌済みタイプで提供されています。

コラゲナーゼ酵素製品－未精製コラゲナーゼ、クロマトグラフィー精製コラゲナーゼ、タンパク質分解活性阻害剤入りコラゲナーゼ、およびブレンド

一般用未精製コラゲナーゼ

a, b FALGPAおよびコラゲナーゼ消化単位（CDU）。いずれも単位/mg/固体で算出。
製品名	コメント	FALGPA^a	CDU^b
C0130	一般用途向け	0.25～1.0	> 125
C1639、I-S型	ろ過滅菌済みC0130	0.25～1.0	> 125
C9891、IA型	一般用途向けI型コラーゲンの2つ目のタイプ	0.5～2.0	> 125
C2674、IA型	細胞培養試験済みC9891	0.5～2.0	> 125
C5894、IA-S型	ろ過滅菌済みC9891	0.5～2.0	> 125
C9722、IA-S型	細胞培養試験済み・ろ過滅菌済みC9891	0.5～2.0	> 125

未精製コラゲナーゼ、使用試験済み

a, b FALGPAおよびコラゲナーゼ消化単位（CDU）。いずれも単位/mg/固体で算出。
製品名	コメント	FALGPA a	CDU b
C6885、II型	インスリンに対する未損傷細胞表面受容体を有する脂肪細胞の消化および放出に適した条件で試験^5,6	0.5～2.0	> 125
C1764、II-S型	ろ過滅菌済みC6885	0.5～2.0	> 125
C5138、IV型	ラットの生存肝細胞の消化および放出に適した条件で試験⁷	0.5～2.0	> 125
C1889、IV-S型	ろ過滅菌済みC5138	0.5～2.0	> 125
C2139、VIII型	脂肪組織試験（C6885参照）5, 6および肝臓組織試験（C5138参照）7の両方に合格。	0.5～2.0	> 125
C9263、V型	ラット膵臓由来のランゲルハンス島（インスリン産生細胞）の消化および放出に適した条件で試験^8,9	1.0～3.0	> 125
C2014、V-S型	ろ過滅菌済みC9263	1.0～3.0	> 125
C7657、XI型	最大のコラゲナーゼ活性があります－ラット膵臓由来のランゲルハンス島（インスリン産生細胞）の消化および放出に適した条件で試験^8,9	2.0～5.0	> 1,200
C9407、XI型	細胞培養試験済みC7657	2.0～5.0	> 1,200
C4785、XI-S型	ろ過滅菌済みC7657	2.0～5.0	> 1,200
C9697、XI-S型	細胞培養試験済み・ろ過滅菌済みC7657	2.0～5.0	> 1,200

クロマトグラフィー精製コラゲナーゼ

a, b FALGPAおよびコラゲナーゼ消化単位（CDU）。いずれも単位/mg/固体で算出。
製品名	コメント	FALGPA^a	CDU^b
C0255、III型	プロテアーゼ活性がごくわずかの精製コラゲナーゼ	4～12	≥ 250
C0773、VII型	精製コラゲナーゼはプロテアーゼおよびクロストリパインをほぼ含みません。	4～12	1,000～3,000
C2799、VII型	細胞培養試験済みC0773	4～12	1,000～3,000
C2399、VII-S型	ろ過滅菌済みC0773	4～12	1,000～3,000
C9572、VII-S型	細胞培養試験済み・ろ過滅菌済みC0773	4～12	1,000～3,000

タンパク質溶解活性阻害剤入り未精製コラゲナーゼ

a, b FALGPAおよびコラゲナーゼ消化単位（CDU）。いずれも単位/mg/固体で算出。
製品名	コメント	FALGPA a	CDU b
C6079、S型	XI型コラゲナーゼとトリプシンプロテアーゼ阻害剤とのブレンド。ラット膵臓由来のランゲルハンス島（インスリン産生細胞）の消化および放出に適した条件で試験8, 9	2～5	1,000以上

Collagenase Blends™

これらの製品は、コラゲナーゼ消化におけるロット間の再現性を高めるために開発されました。精製クロストリジウム中性プロテアーゼに対する精製コラゲナーゼ（ブレンドF）の割合は、ブレンドHおよびLでは異なり、お客様にさまざまな消化の選択肢を提供しています。

a, c FALGPAおよびコラゲナーゼ消化単位（CDU）。いずれも単位/mg/固体で算出。
製品名	コメント	FALGPA^a	プロテアーゼ^c
C7926、ブレンドF	主に真正のコラゲナーゼ。FALGPAの活性はCDUに比べて高いため、II型コラゲナーゼが主に存在すると考えられます。	最小値2.0	< 10
C8051、ブレンドH	コラゲナーゼ活性にはいくつかの中性プロテアーゼ活性も含まれます。	最小値1.0	最小値10
C8176、ブレンドL	真正のコラゲナーゼには、より中性のプロテアーゼ活性が含まれます。	< 1.0	最小値40

Roche社のコラゲナーゼ・Liberase^®酵素

Roche社のコラゲナーゼ酵素は直観的に設計され、信頼性が高く、日常的かつ重要なアプリケーションに対して一貫した性能と再現可能な結果を提供します。コラゲナーゼは、肝細胞、脂肪細胞、膵島、上皮細胞、筋細胞、内皮細胞などの多くの種類の組織由来の細胞の調製に適しています。しかし、組織破壊に用いる酵素の各ロットの適合性は、経験的に決定する必要があります。さらに、私たちのLiberase^®酵素技術は、高度に精製されたコラゲナーゼI型およびII型酵素をDispase^®またはサーモリシンと組み合わせて、広範な組織型の分散を促進します。

リベラーゼ研究用グレードのアプリケーションガイド

*出版物に基づくデータ
組織型	TL	TM	TH	DL	DH
肝臓		+			+
腎臓		+		++
皮膚				+	++
心臓		+	+		+
膵臓（島）	++			+
リンパ節*	++	+
脾臓*	++
肺*	++	++
卵巣組織*		++
脂肪組織*		++
角膜*		++

ディスパーゼ酵素

メルクは、Roche社から販売されている酵素とともに、高度に精製され、お客様の特定のアプリケーションニーズに確実に対応できる組織分散試薬の提供に努めています。細胞膜に損傷を与えない穏やかな酵素であるディスパーゼは、in vitroで増殖する多様な組織や細胞の分離に適しており、懸濁培養では細胞凝集を防ぐことができます。

製品番号	製品名	詳細	価格

コラゲナーゼアッセイ

精製コラゲナーゼ酵素のI型とII型は、天然コラーゲンと合成基質に対する特異性と相対的活性が異なります。これら2つのコラゲナーゼは、私たちのアッセイで用いる2つの異なる基質のうちの1つに対する選好性により、ほぼ区別できます。コラゲナーゼ消化単位（CDU）アッセイ^10,11は、長い非変性コラーゲンタンパク質の3本のヘリックス鎖のうちの2本を切断するI型コラゲナーゼ活性を主に測定します。II型コラゲナーゼ活性は、2つ目のコラゲナーゼ消化アッセイ^12,13において、この酵素が、短い合成ペプチドであるN-[3-(2-フリル)アクリロイル]-Leu-Gly-Pro-Ala（FALGPA、製品番号：F5135参照）を切断する能力で測定されます。種々のタイプのコラーゲンまたは哺乳動物組織の消化に関して、コラゲナーゼI型とII型の精製調製物のいずれか単独では、これらの両酵素型の混合物と比較して効果が低いことが示されています。このコラゲナーゼI型とII型のみを含む精製コラゲナーゼは、組織の消化に関して、全未精製コラゲナーゼや、精製コラゲナーゼとさまざまなプロテアーゼの併用よりも効果が劣ります。真正のコラゲナーゼと、性質が進化した別の天然プロテアーゼであるクロストリパインとアミノペプチダーゼとを併用すると、明らかに、さまざまな動物組織のコラーゲンの消化において互いに補い合っています。組織消化には、常に未精製コラゲナーゼ製品が最も有効でした。一部の研究者は、組織の消化に、クロマトグラフィー精製コラゲナーゼとトリプシンやスブチリシンなどのプロテアーゼとの混合物を試みています。

メルクでは、コラゲナーゼ活性を測定するCDUおよびFALGPAアッセイに加えて、各製品ロットのカゼイナーゼ^14,15、クロストリパインおよびトリプシン活性を試験し、コラゲナーゼ製品中のタンパク質分解酵素活性を調べています。動物組織の消化を助けるタンパク質分解活性を測定するために、この3つのアッセイのうちで最も重要なのがカゼイナーゼアッセイです。未精製コラゲナーゼ中に存在するクロストリパインは、活性を得るためには還元されなければならないため（例：ジチオスレイトールによる処理）、この酵素はおそらくラボにおける組織分散過程にはほとんど寄与しないと考えられます。一部の研究者から、クロストリパインが有害または毒性を有する可能性が報告されているため、モニタリングを行っています。

酵素規格に適合するコラゲナーゼ製品の多くは、ラットから得られたさまざまな組織を用いて使用試験も行われています。II型（C6885、C1764）およびVIII型（C2139）コラゲナーゼロットについて、ラット精巣上体脂肪パッド⁵から脂肪細胞を遊離させる能力を試験します。次いで、脂肪細胞の代謝活性を、インスリン添加の有無にかかわらずグルコース酸化速度を測定することによりスクリーニングします。IV型（C5138、C1889）およびVIII型（C2139）ロットは、ラット肝臓から生細胞を遊離させる能力について試験されていまする⁷。V型（C9263、C2014）、XI型（C7657、C4785、C9407、C9697）、S型（C6079）コラゲナーゼのロットでは、製品試験に合格するためにはラット膵臓から無傷のランゲルハンス島を遊離させなければなりません⁸。

コラゲナーゼによる組織の分解／分散のトラブルシューティング・参考文献

私たち自身の研究開発結果に基づいて、またお客様との話し合いから、特定の組織の切断および調製の方法が、コラゲナーゼによる組織の消化-分散の速度や効率に重要な影響を及ぼすことは明らかです。組織ドナーの年齢の差も、経時的な変動の主な原因となり得ます。消化緩衝液中にカルシウムイオンが5 mMで存在することを確認してください。キレート剤のEGTAおよびEDTAは、酵素の安定や活性に必要なカルシウムイオンを除去することにより、コラゲナーゼ活性を著しく阻害する可能性があります。その他の阻害物質として、β-メルカプトエタノール¹⁶、システイン¹⁶、8-ヒドロキシキノリン-5-スルホン酸¹⁶などがあります。より高い比活性を有する新しいコラゲナーゼロットは、確立された濃度で過剰な細胞死を引き起こす可能性があります。その場合は、コラゲナーゼの使用量を減らしたり、BSAまたは血清（それぞれ最大0.5%および5～10%）を加えて細胞を安定化させ、さらなる消化を行ってください。

問題点	原因	解決策	参考文献
消化が不良である	酵素が不活性カルシウムイオンが不十分酵素が不十分	コラゲナーゼを冷所かつ乾燥した場所で保存する。コラゲナーゼ溶液を分注し、凍結保存する。コラゲナーゼ溶液に5 mM Ca⁺⁺を添加する。コラゲナーゼの量を増やす。プロテアーゼ活性が高いメルクのブレンドを試す。	6 7
遊離された細胞が捕捉されている	破砕された細胞からDNAが放出された不適切な非タンパク質性の粘性物質が存在する	攪拌を穏やかにする DNAseを添加する組織を十分に洗浄してから組織を消化する* 消化溶液中でMg⁺⁺を使用しない酵素入りのヒアルロニダーゼを添加する**	7 9 7 7 18
細胞が死んでいる	プロテアーゼの量が過剰 pHの変化酸素が少なすぎる	プロテアーゼへの曝露量を減らす* アルブミンまたは加熱血清を添加する HCO^-₃の代わりに緩衝液（例：HEPES）を使用する。 pHを頻回に確認し再調整する消化溶液を通気する（空気またはO₂）酵素を増やして消化を速める	7 19
細胞の収率が低い	酵素のバランス接着因子	コラゲナーゼ量を増やす* コラゲナーゼを含むエラスターゼを添加する最初に組織を洗浄してCa⁺⁺を除去する*	20 7
多くの細胞が損傷している	プロテアーゼが過剰物理的損傷	プロテアーゼの使用量を減らす* アルブミンまたは加熱血清を添加する組織および細胞を極力穏やかに取り扱う	21 7
新しいロットが機能しない	ロットのばらつき	分画コラゲナーゼ「ブレンド」（製品番号：C7926、C8051、C8176）を使用する*

*「ブレンド」製品（番号：C7926、C8051、C8176）中ではコラゲナーゼおよびプロテアーゼ酵素が個別に調製されるため、それぞれの使用量の管理が良好に再現できます。

**DNAseは過度の攪拌のせん断によって不活性化され、また添加された酵素はコラゲナーゼ中に存在する中性プロテアーゼによって消化される可能性があります。

***EGTA（またはEDTA）を用いてCa++を除去し、微生物を洗い出した後、組織を緩衝液で洗浄してキレート剤を除去します。酵素溶液にEGTAやEDTAを添加してはなりません。

参考文献

Harper E. 1980. Collagenases. Annu.Rev. Biochem.. 49(1):1063--1078. https://doi.org/10.1146/annurev.bi.49.070180.005215

MacLennan JD, Mandl I, Howes EL. 1953. BACTERIAL DIGESTION OF COLLAGEN 1. J. Clin. Invest.. 32(12):1317-1322. https://doi.org/10.1172/jci102860

Bond MD, Van Wart HE. 1984. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23(13):3085-3091. https://doi.org/10.1021/bi00308a036

Matsushita O, Jung C, Katayama S, Minami J, Takahashi Y, Okabe A. 1999. Gene Duplication and Multiplicity of Collagenases in Clostridium histolyticum. J. Bacteriol.. 181(3):923-933. https://doi.org/10.1128/jb.181.3.923-933.1999

Rodbell M. 1964. Metabolism of Isolated Fat Cells. Journal of Organometallic Chemistry. 239(2):375-380. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)51687-2

Fain JN. 1975. [53] Isolation of free brown and white fat cells.555-561. https://doi.org/10.1016/0076-6879(75)35184-7

Seglen PO. 1976. Chapter 4 Preparation of Isolated Rat Liver Cells.29-83. https://doi.org/10.1016/s0091-679x(08)61797-5

Lacy PE, Kostianovsky M. 1967. Method for the Isolation of Intact Islets of Langerhans from the Rat Pancreas. Diabetes. 16(1):35-39. https://doi.org/10.2337/diab.16.1.35

Buitrago A, Gylfe E, Henriksson C, Pertoft H. 1977. Rapid isolation of pancreatic islets from collagenase digested pancreas by sedimentation through percoll? at unit gravity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 79(3):823-828. https://doi.org/10.1016/0006-291x(77)91185-8

10.

Moore S, Stein WH. 1948. PHOTOMETRIC NINHYDRIN METHOD FOR USE IN THE CHROMATOGRAPHY OF AMINO ACIDS. Journal of Biological Chemistry. 176(1):367-388. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)51034-6

11.

“Enzymatic Assay of Collagenase.Collagen Digestion Assay”, our quality control test procedure..

12.

Van Wart HE, Steinbrink D. 1981. A continuous spectrophotometric assay for Clostridium histolyticum collagenase. Analytical Biochemistry. 113(2):356-365. https://doi.org/10.1016/0003-2697(81)90089-0

13.

“Enzymatic Assay of Collagenase Using FALGPA as the Substrate”, our quality control test procedure..

14.

Anson M, Gen.Physiol. J. The Estimitation of Pepsin, Trypsin, Papain and Cathepsin with Hemoglobin.22, 79 (1938).

15.

“Enzymatic Assay of Caseinase (Collagenase Products)”, our quality control test procedure..

16.

Seifter S, Gallop PM, Klein L, Meilman E. 1959. Studies on Collagen. Journal of Biological Chemistry. 234(2):285-293. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)70290-1

17.

Berry MN, Friend DS. 1969. HIGH-YIELD PREPARATION OF ISOLATED RAT LIVER PARENCHYMAL CELLS. 43(3):506-520. https://doi.org/10.1083/jcb.43.3.506

18.

Bellemann P, Gebhardt R, Mecke D. 1977. An improved method for the isolation of hepatocytes from liver slices. Analytical Biochemistry. 81(2):408-415. https://doi.org/10.1016/0003-2697(77)90711-4

19.

Ives HE, Schultz GS, Galardy RE, Jamieson JD. 1978. Preparation of functional smooth muscle cells from the rabbit aorta.. 148(5):1400-1413. https://doi.org/10.1084/jem.148.5.1400

20.

Fain JN, Loken SC. 1969. Response of Trypsin-treated Brown and White Fat Cells to Hormones. Journal of Biological Chemistry. 244(13):3500-3506. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)83400-7

21.

Berry, M, Edwards, Aa, Barritt, G. 1991. Isolated Hepatocytes; Preparation, Properties and Applications.Elsevier..

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