酵母形質転換のプロトコル

はじめに

酵母は成長が速く、細胞が分散しているため、真核生物の研究に適したモデル生物と考えられています。さらに、酵母はレプリカ平板による培養や、突然変異株の単離が比較的容易にでき、遺伝システムが詳細に明らかにされています。最も重大な点は、酵母が効率的なタンパク質製造に汎用可能であるDNA形質転換システムを有していることです。

酵母の形質転換

表1 シグマアルドリッチの酵母形質転換用製品

カタログ番号	製品名	用途	特長／利点
YEAST1	酵母形質転換キット　製品に含まれる構成品： 10 µgコントロール酵母プラスミドDNA、 pRS316 ・100 mL PLATEバッファー ・100 mL形質転換バッファー	酵母のすべての株の形質転換に適している。簡便で、フレキシブルかつ高効率。わずか10 ngのDNAで陽性形質転換体を得ることが可能；最適効率は0.1～3 µgの範囲。	簡便で、すぐに使用可能 必要なプラスミドDNA量はわずか10 ng どのような酵母株にも対応可能  標準的な形質転換100回分に十分な量
L4158	酢酸リチウム二水和物	酵母の形質転換を促進	BioXtraグレード
T9285	Tris-EDTA バッファー溶液TE バッファーには、0.1M EDTA・1 M Tris-HCl（pH8.0）が含まれる。	TE（Tris-EDTA）バッファーは、分子生物学実験で汎用されている。TEバッファーはDNA・RNAを可溶化し、分解を防ぐ。	精製プラスミドを含むDNA・RNAの保管に適している
D8418	ジメチルスルホキシド（DMSO）	形質転換用のバッファー調製や、DEAE-デキストランを用いた細胞の形質導入、40-50% PEGによる細胞融合ほか、複数のアプリケーションに用いることが可能	形質転換効率を2～5倍高める DNase、RNase、ホスファターゼ、プロテアーゼを含まず
D9156	サケ精巣由来の一本鎖デオキシリボ核酸（DNA）	酵母の形質転換に使用可能	このDNAは、エタノール沈殿後、超音波処理することにより調製された一本鎖断片で、587～831塩基対のマーカー断片と同じ泳動パターンを示す。

酵母形質転換のプロトコル

プロトコル概要

LiAc形質転換法は、酵母のコンピテントセルの作成、プラスミドDNAによる形質転換、平板培養による形質転換体の選択、という主に3つのステップで構成されます。酵母の形質転換体は通常、栄養要求性マーカーを用いて選択するため、形質転換体のスクリーニングには適切な合成ドロップアウト培地を使用します。

必要な試薬：

ストック溶液
50 % ポリエチレングリコール溶液（分子量 約36,500)
1 M Tris -HClおよび0.2 M EDTA、 pH 8.0 (TE緩衝液) (カタログ番号：T9285)
1 M 酢酸リチウム、 pH 7.5 (カタログ番号：L4158)

1倍 TE-LiAc溶液
10 mM Tris -HCl、 pH 8.0、1 mM EDTAおよび0.1 M 酢酸リチウム添加

PEG-TE-LiAc 溶液
40 % PEG 10 mM Tris -HCl、 pH 8.0、1 mM EDTAおよび0.1 M 酢酸リチウム添加

酵母の形質転換

1. YPDおよび合成完全（SC）ドロップアウト培地プレートを準備し、別々にオートクレーブします（表1 ・2）。
2. 酵母細胞をプレートから採取し、YPD液体培地20 mL入り100 mL滅菌フラスコに播種します。
3. 振盪しながら一晩増殖させます。
4. 上述の培地中の細胞をYPD液体培地100 mLに加え、OD 600が0.3になるように希釈します。
5. 細胞を丁寧に遠心し、ペレットにします。
6. 1倍TE-LiAc溶液7～8 mLに再懸濁し、23℃で1～1.5時間ローテーターで撹拌します。
7. 形質転換用の滅菌済みマイクロチューブに10 mg/mLサケ精巣DNA（カタログ番号：D9156）10 µLを加え、ネガティブコントロール用1本にも同様に加えます。
8. 酵母プラスミドDNA（試験用）0.1 µgを各チューブに加えます。さらにコンピテント細胞100 µLを各チューブに加えてボルテックスします。
9. 調製直後のPEG-TE-LiAc溶液600 µLを加えボルテックスし、30℃で30分間、振盪培養します。
10. オプション－DMSO（カタログ番号：D8418）を10%（v/v）濃度になるまで添加し、その後42℃で15分間ヒートショックを与えてもよいです。
11. 3秒間スピンし、細胞を滅菌水に再懸濁し、適切なSCドロップアウト培地に播種します。
    

注記：酵母のプレーティングについては増殖プロトコルを、形質転換体の単離については下記項を参照。

形質転換体の単離

酵母形質転換体は通常、URA3相補法を用いて選択しますが、相補アミノ酸およびblue-whiteスクリーニング法を用いた技法も使用できます。

URA3ベースの選択法は、プラスミドDNAに酵母URA3遺伝子の正常コピーとURA3プロモーターがあるのに対し、酵母変異株はURA3対立遺伝子が欠損しています。プラスミドで形質転換した酵母細胞はURA3遺伝子の機能的コピーがあるため、ウラシル欠損の酵母用合成ドロップアウト培地添加剤で増殖させることができます（カタログ番号：Y1501）。

図1． 酵母の形質転換

参考文献

1. Sherman F. 2002. Getting started with yeast.3-41. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(02)50954-x

2. MacDonald PN. 2001. Two-Hybrid Systems. https://doi.org/10.1385/1592592104

3. Treco DA, Winston F. 2008. Growth and Manipulation of Yeast. Current Protocols in Molecular Biology. 82(1): https://doi.org/10.1002/0471142727.mb1302s82

4. Schiestl RH, Gietz RD. 1989. High efficiency transformation of intact yeast cells using single stranded nucleic acids as a carrier. Curr Genet. 16(5-6):339-346. https://doi.org/10.1007/bf00340712

5. Li B, Fields S. 1993. Identification of mutations in p53 that affect its binding to SV40 large T antigen by using the yeast two?hybrid system. FASEB j.. 7(10):957-963. https://doi.org/10.1096/fasebj.7.10.8344494