マルチプレックスマイオカイン解析：複数の筋分泌因子を同時に測定

• マイオカインとは？
• マイオカインマルチプレックス解析
• 方法
• マルチプレックス解析結果
• まとめ
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  • マイオカインアッセイ
  • 老化アッセイ
• 参考文献

マイオカインの多様な系は、さまざまなシグナル伝達経路に関与しています。MILLIPLEX^® Human Myokine Panelのようなマルチプレックスマイオカインイムノアッセイにより、研究者は複数の筋分泌因子を同時に測定することができ、関連する疾患についてより多くの知見を得ることができます。

マイオカインとは？

骨格筋は、「マイオカイン」と総称される多くのタンパク質の合成・分泌に活発に関与しています。¹ マイオカインは、図1に示すように、オートクラインおよび／またはパラクラインとして作用し、骨格筋の代謝、増殖、分化（筋成長）を制御します。

マイオカインは、内分泌ホルモンとしても作用し、細胞代謝、内皮機能、腫瘍増殖／抑制を変化させます。これらのマイオカインは、心臓、脂肪組織、乳房、結腸、肝臓、腸、内皮、骨、骨格筋など、さまざまな組織における炎症反応にも関与しています。運動による抗炎症作用、抗病作用は、これらのマイオカインによって介在されている可能性があり、マイオカインのシグナル伝達経路は、自然免疫、神経シグナル伝達、インスリン反応と交差しているという事実が新たに支持されています。^2,3

また、骨格筋の機能・量の低下が進行するサルコペニアは、老化の重大な特徴であり、機能低下やせん妄などの老年症候群の主要な構成要素です。筋由来の成長因子やサイトカイン、つまりマイオカインが加齢性疾患の進行を調節し、全身性老化の根底にある組織間コミュニケーションに寄与することを示すエビデンスが多く報告されています。

マイオカインマルチプレックス解析

前臨床試験やトランスレーショナルリサーチにおいて、マイオカイン定量の必要性が高まっているため、この研究におけるマルチプレックスイムノアッセイも必要になってきています。マイオカインのマルチプレックス解析により、研究者は複数のマイオカインを同時に測定することができます。例えば、MILLIPLEX^® Human Myokine Panel は、表1に示された血清または血漿中のアナライトの一部または全部を同時に定量するための15プレックスキットです。

表1.MILLIPLEX^® Human Myokine Panelに含まれるアナライトとその生物学的機能

方法

MILLIPLEX^® Human Myokine Magnetic Bead Panelを用いて、血清・血漿サンプルおよびアッセイキットに含まれるスタンダードを用いてマルチプレックスアッセイを行いました。付属のプロトコルの説明に従って実施しました。キャプチャ抗体結合ビーズとサンプルをインキュベートし、ビーズ上のキャプチャ抗体とアナライトが結合します。ビオチン化検出抗体を添加し、検出抗体がアナライトと結合することで、サンドイッチを形成します。Streptavidin-phycoerythrin（SA-PE）色素を添加し、色素がサンドイッチに結合して蛍光を発します。

マルチプレックス解析結果

Serum Matrixで段階希釈した各アナライトのスタンダードを用いて、アッセイ応答（アナライト濃度に対する平均蛍光強度［MFI］）を決定するための標準曲線を作成しました。標準曲線は、すべてのアナライトに対して3～5オーダーの直線的なMFI値を示すことが確認されました（図2）。

交差反応性

パネル内で有意な交差反応性は認められませんでした。このヒトマイオカインパネルに含まれる抗体のうち、Fractalkine、LIF、IL-6を除くほとんどの抗体はサルと交差反応性があります。以下の交差反応性が認められました。

• Apelinは、マウス、イヌ、ウサギ、ブタと交差反応性を示す
• BDNFは、マウスおよびウサギと交差反応性を示す
• EPOは、イヌおよびウサギと交差反応性を示す
• IL-15は、ウマと交差反応性を示す
• Myostatinは、イヌ、ブタ、ウマと交差反応性を示す
• FABP3 は、ラット、ウサギ、ブタ、ウマと交差反応性を示す
• FSTL1 は、マウス、ウサギ、ブタ、ウマと交差反応性を示す
• OSMは、イヌおよびブタと交差反応性を示す
• FGF-21 は、イヌ、ブタ、ウマと交差反応性を示す

なお、今回の研究では、限られた量の健常サンプルしか検査していないため、他の健常サンプルや疾患サンプルでの交差反応性の可能性も排除できません。

添加回収率 （Spike Recovery）

既知量の各アナライト（標準曲線上のポイント3、4、5）を健常ヒト血清／血漿サンプルに添加しました。回収率は以下の式で算出しました。

算出されたアナライトの濃度／期待される濃度×100

すべての添加サンプルの回収率は70%から130%でした。

他のマルチプレックスパネルとの一貫性と正確性

MILLIPLEX^®アッセイ間の一貫性と正確性を検証するために、このヒトマイオカインパネルと他の MILLIPLEX^®パネルの両方に含まれるアナライトの定量性を比較しました。すべての標準曲線は重なり合った反応を示し、生体サンプルから算出されたアナライト濃度は非常に高い相関を示しました。

例えば、FGF-21とFABP3のサンプル値は、MILLIPLEX^® Human Myokine PanelとMILLIPLEX^® Human Liver Protein and Human CVD1 Panelの両方を使用して測定されました。標準曲線は精製FGF-21のスタンダードを用いて作成されました。2つのパネルから得られたFABP3は、アッセイ応答とアッセイの直線範囲が重複していることが示されました。アッセイ相関は良好で、傾きとR値は1に近づきました（図3）。

FGF-21とFABP3に加えて、このヒトマイオカインパネルと他のMILLIPLEX^® パネルの同じアナライトを比較しました。すべての標準曲線は、重複した反応を示し、アナライト濃度は生体サンプルと非常によく相関しました（データ未掲載）。

健常サンプルと敗血症サンプルの比較

最後に、健常者と敗血症患者の血清／血漿サンプルを用いて、アッセイパネルの生物学的検証を行いました。予想通り、15種類の新規マイオカインがアッセイによって同時に定量できました。FABP3、Irisin、FSTL1、OSM、IL-6、FGF-21、Musclinは、敗血症サンプルで有意に上昇しました（表2）。

健常サンプルのデータ [pg/mL]

敗血症サンプルのデータ [pg/mL]

表2.健常および敗血症の血清／血漿サンプルで発現したバイオマーカーの比較。FABP3、Irisin、FSTL1、OSM、IL-6、FGF-21、Musclinは、敗血症サンプルで発現が増加することが示された。*アッセイ未実施。

まとめ

MILLIPLEX^® Human Myokine Panel は、感度、精度、再現性に優れたパネルです。この新しいパネルで得られたサンプル値は、同じアナライトを含む従来のパネルと一貫しています。本パネルは、代謝性疾患、神経筋疾患、特発性筋疾患などの多様な研究領域において、理想的なイムノアッセイです。

関連製品

研究目的での使用に限定されます。診断目的では使用しないでください。