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Kit High Pure RNA Tissue

sufficient for 50 isolation(s), suitable for RT-PCR, suitable for Northern blotting

• Sinonimo/i: purificazione di RNA
• Codice UNSPSC: 41105500

Proprietà

• impiego: sufficient for 50 isolation(s)
• Livello qualitativo: 100
• Produttore/marchio commerciale: Roche
• Confezionamento: kit of for 50 isolations
• tecniche: Northern blotting: suitable; RT-PCR: suitable

Descrizione

Descrizione generale

Il kit High Pure RNA Tissue è progettato per la purificazione di RNA totale, integro e non contaminato da DNA da campioni di tessuto. Isolamento di RNA con resa da bassa a media. Gli acidi nucleici, in presenza di un sale caotropico (guanidina HCl), si legano alla superficie di fibre in lana di vetro. Questo permette alla provetta filtrante da centrifuga High Pure Spin di immobilizzare specificamente gli acidi nucleici (DNA e RNA) ed eliminare i contaminanti. Nel caso si voglia isolare solo l'RNA, le condizioni di legame possono essere ottimizzate in modo da garantire l′immobilizzazione di tutto l′RNA. Questo kit per l′isolamento di RNA ad elevata purezza consente di isolare rapidamente l'RNA totale integro da un'ampia gamma di campioni, tra cui cellule in coltura, sangue di mammiferi, globuli bianchi (WBC), lieviti e batteri. Isola rapidamente l'RNA totale dai tessuti di mammifero quali fegato, milza, polmone e cuore di topo.

Capacità: le provette filtranti High Pure Spin possono contenere fino a 700 μL di campione.
Campione: tessuto solido (per es., fegato, milza, polmone e cuore di topo): 1 - 25 mg.

N.B.: la quantità di campione dipende dal metodo usato per preparare il tessuto; quantitativi maggiori di campione (>10 mg) devono essere processati mediante omogeneizzazione con rotore-statore.

Applicazioni

Il kit High Pure RNA Tissue è stato usato per:

• estrazione dell′RNA totale da cellule umane per la preparazione di librerie di cDNA
• estrazione dell'RNA totale da cellule in coltura per analisi di real time PCR
• estrazione dell′RNA totale da ippocampo di ratto
• purificazione dell'RNA totale da cellule in coltura e midollo spinale umano
• isolamento dell'RNA totale di tessuti raccolti dalle pareti del ventricolo

L'RNA isolato può essere successivamente utilizzato in molte applicazioni:

• Northern blotting
• RACE
• saggio di estensione del primer
• display differenziale
• saggio di protezione dalla RNAsi
• traduzionein vitro

Caratteristiche e vantaggi

• Preparazione dei campioni di RNA in 30 minuti circa.
• Isolamento di RNA concentrato idoneo per applicazioni a valle.
• Minime perdite di RNA con un kit che rimuove i contaminanti senza precipitazione né altri passaggi che potrebbero degradare l′RNA.
• Nessun impiego di composti organici pericolosi quali cloruro di cesio, fenolo, cloroformio e bromuro di etidio.

Componenti

• Tampone di lisi/legame
• DNasi I, liofilizzata
• Tampone di incubazione della DNasi
• Tampone di lavaggio I
• Tampone di lavaggio II
• Tampone di eluizione
• Provette filtranti per centrifuga High Pure (contenenti lana di vetro)
• Provette di raccolta

Qualità

• Il tessuto viene disgregato e omogeneizzato in tampone di lisi/legame e purificato come descritto.
• Misurando la densità ottica a 260 nm si determina la resa dell′RNA.
• Attraverso la disposizione della banda dell′RNA ribosomiale in un gel di agarosio denaturante si esaminano l′integrità e la distribuzione dimensionale.
• 10 μL dell′eluato di RNA si utilizzano nella sintesi del primo filamento con la trascrittasi inversa M-MuLV e p(dT)₁₅ come primer. Nella PCR che segue, condotta con il sistema Expand High Fidelity PCR e con primer specifici per la glicerinaldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) si ottiene come previsto il prodotto di amplificazione di 983 bp.
• Con una PCR senza una precedente reazione RT si esamina l′assenza di DNA contaminante e non si ottiene alcun prodotto di amplificazione.

Nota sulla preparazione

I campioni di tessuto vengono disgregati e omogeneizzati in presenza di un sale caotropico (guanidina HCl) che inattivi le RNasi. L′omogenato viene quindi posto nella provetta filtrante da centrifuga High Pure Spin contenente lana di vetro. Nelle condizioni tampone usate, tutti gli acidi nucleici si legano alla lana di vetro mentre le sostanze contaminanti (sali, proteine e altri contaminanti cellulari) non vengono legate. Il DNA legato viene poi digerito, direttamente sul filtro, dalla DNasi I. Brevi passaggi di lavaggio e centrifuga rimuovono rapidamente i frammenti di DNA digeriti e gli altri contaminanti cellulari. L′RNA purificato rimasto legato viene quindi eluito in un piccolo volume di tampone a basso tenore salino.

Altre note

Kit High Pure technology e Silica Adsorption
Solo per scopi di ricerca nel settore life science. Non usare in procedure diagnostiche.

Figura 1: Confronto di differenti procedure di omogeneizzazione. Il fegato di topo è stato omogeneizzato con diverse procedure. Da ciascun omogenato, con il kit High Pure RNA Tissue è stato purificato l′RNA totale. Aliquote dell′RNA isolato sono state sottoposte a trascrizione inversa con primer specifici per una regione del GADH mRNA. I prodotti del cDNA sono stati analizzati con elettroforesi su gel.

Corsia 1: Omogeneizzazione: Ultra Turrax; resa: 1,9 μg/mg di tessuto; A 260/A 280: 2,0
Corsia 2: Omogeneizzazione: a motore, pestello monouso in plastica; resa: 3 μg/mg di tessuto; A 260/A 280: 2,0
Corsia 3: Omogeneizzazione: mortaio e pestello, ago da 20 G; resa: 1,5 μg/mg di tessuto; A 260/A 280: 2,0
Corsia 4: Omogeneizzazione: pestello monouso manuale in plastica, ago da 20 G; resa: 1,8 μg/mg di tessuto; A 260/A 280: 2,0
Corsia 5: Omogeneizzazione: pestello monouso manuale in plastica; resa: 3,4 μg/mg di tessuto; A 260/A 280: 2,0
Corsia 6: Omogeneizzazione: vortex a microsfere; resa: 3 μg/mg di tessuto; A 260/A 280: 2,0
Corsia 7: Marcatore del peso molecolare

Informazioni sulla sicurezza

• Pittogrammi: GHS07,GHS08
• Avvertenze: Danger
• Indicazioni di pericolo: H302 + H332,H315,H317,H319,H334
• Consigli di prudenza: P261 - P264 - P280 - P284 - P304 + P340 + P312 - P342 + P311
• Classi di pericolo: Acute Tox. 4 - Acute Tox. 4 Oral - Eye Irrit. 2 - Resp. Sens. 1 - Skin Irrit. 2 Inhalation - Skin Sens. 1
• Codice della classe di stoccaggio: 12 - Non Combustible Liquids
• Classe di pericolosità dell'acqua (WGK): WGK 1
• Punto d’infiammabilità (°F): does not flash
• Punto d’infiammabilità (°C): does not flash