Caratterizzazione di farmaci biologici e di biosimilari

Identità

Determinazione della massa intatta:

La determinazione della massa molecolare intatta, spesso condotta mediante analisi SEC-MS e standard adeguati è uno step necessario nella caratterizzazione di un farmaco biologico, dalla selezione clonale alla verifica del prodotto finale. L’analisi della massa molecolare intatta si usa comunemente per distinguere i diversi prodotti proteici/peptidici e verificare l’identità dei composti biologici. Se ottimizzata, inoltre, permette di determinare il peso molecolare intatto di tutti i prodotti proteici, inclusi gli anticorpi monoclonali bispecifici.

Invece di avere a che fare con la massa intatta di una proteina biologica di grandi dimensioni, difficile da analizzare, è possibile ricorrere ad un approccio che prevede un’analisi della digestione delle proteine in cui inizialmente il campione viene degradato a pochi frammenti appena, che è poi possibile separare ed analizzare ad uno ad uno facendo ricorso a standard specifici per la spettrometria di massa per la proteomica.

Determinazione del titolo

La capacità di una linea cellulare di produrre sufficienti quantità di anticorpo monoclonale (mAb) ne influenza il potenziale commerciale. Impiegato come valore di base, il titolo del mAB si determina mediante cromatografia di affinità con proteina A (HPLC). Nelle fasi iniziali dello sviluppo di un mAb, si rende necessaria la determinazione del titolo di IgG in un gran numero di raccolte di colture cellulari. La cromatografia di affinità che impiega come ligando la proteina A viene spesso usata per determinare la concentrazione dell’anticorpo monoclonale e per purificarlo per le successive analisi degli aggregati e delle varianti di carica.

Analisi degli amminoacidi

L’analisi degli amminoacidi è un metodo diffuso per stabilire l’identità di un prodotto e viene usato per la determinazione della composizione in amminoacidi di un mAb. Spesso tale analisi si esegue insieme a una misurazione del coefficiente di estinzione, un metodo impiegato di routine per stabilire il titolo di produzioni differenti.

L’impiego di materiali di riferimento certificati, con titoli assegnati mediante procedure metrologicamente valide, è un approccio strategico fondamentale per ridurre al minimo e controllare le variazioni sperimentali in tutti i passaggi del processo di analisi degli amminoacidi, quali l’estrazione, il frazionamento, l’arricchimento, la proteolisi e l’analisi delle proteine.

Mappatura dei peptidi

Per raccogliere indicazioni utili circa l’identità dell’anticorpo monoclonale può essere sufficiente il confronto delle mappe peptidiche ottenute con un singolo enzima. Una caratterizzazione più dettagliata dell’anticorpo terapeutico, per esempio mediante sequenziamento N- o C-terminale o mediante caratterizzazione dei glicani, insieme all’esame di altri aspetti della produzione, dell’analisi, della purificazione e della frammentazione dell’anticorpo, possono portare ad una migliore ingegnerizzazione di prodotto. La spettrometria di massa per la proteomica può fornire ulteriori informazioni strutturali.

Modificazioni post-traduzionali (PTM)

Analisi degli N-glicani:

Una elevata variabilità nella glicosilazione di un anticorpo monoclonale può incidere sulla purezza dell’anticorpo e determinare un’attività incostante. Sulla catena principale degli anticorpi monoclonali sono presenti N-glicani che possono essere rilasciati e analizzati con metodi di LC-MS, in modo da definire i pattern di glicosilazione che caratterizzano l’anticorpo. La caratterizzazione degli N-glicani presenti su un anticorpo monoclonale è necessaria per acquisire i dettagli strutturali completi della molecola sotto indagine. Lo studio degli N-glicani è importante dal momento che essi influenzano molte proprietà delle glicoproteine, incluse la conformazione, la solubilità, l’antigenicità e la possibilità di essere riconosciute dalle proteine che formano legami con i glicani.

Studio della struttura di ordine superiore (HOS) degli anticorpi monoclonali

I fattori che influenzano la HOS – la struttura 3D di un mAb – sono numerosi e vanno dalla scelta della linea cellulare per la produzione dell’anticorpo fino alle condizioni in cui viene condotto il bioprocesso, quali per esempio la temperatura, il pH e l’esposizione alla luce. Lo scambio idrogeno-deuterio accoppiato alla spettrometria di massa (HDX-MS) è una tecnica impiegata per ottenere una conoscenza approfondita della struttura terziaria dell’anticorpo monoclonale.

Analisi delle modificazioni degli mAb

Durante il processo di produzione dell’anticorpo monoclonale possono verificarsi numerose modificazioni post-traduzionali, largamente influenzate da parametri quali il terreno di coltura, la temperatura ecc. Per riuscire a produrre un anticorpo che sia costante da un lotto all’altro è fondamentale che queste modificazioni vengano replicate in ogni tornata di sintesi. L’analisi delle modificazioni include la mappatura dei ponti disolfuro e la valutazione della struttura di base dei glicani. È bene inoltre quantificare la sialilazione, dal momento che l’acido sialico può esercitare effetti negativi sull’anticorpo monoclonale.

Distribuzione della carica elettrica degli mAb

Le varianti di carica, derivanti da modificazioni post-traduzionali (PTM) o da modificazioni chimiche, possono avere un impatto considerevole sull’attività biologica e farmacocinetica di un anticorpo monoclonale. L’analisi delle varianti di carica, un requisito regolatorio per gli anticorpi monoclonali, viene effettuata con tecniche che includono la cromatografia a scambio cationico (CEX) e la focalizzazione isoelettrica capillare (cIEF).

Analisi fisica e distribuzione dimensionale di mAb

Analisi fisica degli mAb

L’analisi fisica viene utilizzata per caratterizzare le proprietà macroscopiche dell’anticorpo monoclonale, per esempio misurandone il pH, l’osmolarità e la concentrazione. I protocolli di test prevedono anche la valutazione dell’integrità del confezionamento, ad esempio mediante la titolazione Karl Fischer per la determinazione dell’umidità o mediante il test “dye ingress” per confermare l’integrità della chiusura.

Distribuzione dimensionale degli mAb

Se è vero che il prodotto desiderato è un mAb unico, il materiale di produzione iniziale contiene spesso delle varianti dimensionali, come aggregati, frammenti e biomolecole, che presentano catene leggere aggiuntive. Dal momento che questi elementi potrebbero influire sull’immunogenicità e l’efficacia dell’anticorpo, è importante monitorarne la presenza. La cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) è il metodo di purificazione più usato per valutare la distribuzione dimensionale di un mAb.

Sterilità e impurezze

Impurezze dovute alle proteine della cellula ospite

Le impurezze dovute alle proteine della cellula ospite (HCP), presenti a livello di ppm nelle terapie biologiche, costituiscono un rischio di immunogenicità primario dal momento che possono suscitare nei pazienti una risposta immunitaria imprevedibile. La loro natura complessa e variegata ne rende difficile la rilevazione e il monitoraggio. Mentre molte delle impurezze dovute alle proteine della cellula ospite vengono efficacemente rimosse nei canonici processi di purificazione a valle, una piccola frazione di HCP risulta particolarmente difficile da eliminare. Per ridurre i livelli di HCP difficili da rimuovere, quali la lipoproteina lipasi, provenienti da cellule CHO (Chinese hamster ovary) e migliorare quindi la stabilità delle formulazioni di anticorpi monoclonali contenenti polisorbato, si può ricorrere a tecniche di knockout genico (delezione selettiva).

Monitoraggio degli additivi utilizzati in produzione:

Nel corso dello sviluppo e della produzione di anticorpi monoclonali è necessario monitorare i livelli di un’ampia gamma di additivi, tra cui detergenti, Proteina A, reagenti di transfezione, antibiotici, antischiumogeni e fattori di crescita.

Analisi microbiologiche degli mAb

Lo sviluppo e la produzione di sostanza farmaceutiche rispondenti alle GMP e conformi richiede necessariamente un certo numero di procedure di analisi microbiologica. Dal momento che,per beneficiare della rapida velocità di crescita e delle rese elevate, molti anticorpi monoclonali vengono prodotti in microrganismi, è importante monitorare e controllare la presenza di contaminanti microbici. L’endotossina, un componente della parete cellulare dei batteri Gram negativi, induce risposte che vanno dalla comparsa di febbre con brividi fino allo shock settico fatale: perciò il test dell’attivazione monocitaria (MAT in vitro) per la ricerca dei pirogeni e la susseguente rimozione dell’endotossina dall’anticorpo costituiscono un passaggio cruciale e un requisito previsto dalle norme. L’analisi della carica microbica deve essere effettuata durante tutto il processo di produzione dell’anticorpo monoclonale, in modo da monitorare la presenza di una contaminazione microbica potenzialmente pericolosa. Anche i Test di sterilità sono cruciali per avere conferma dell’integrità della produzione degli anticorpi monoclonali.

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