Saggi per la ricerca dei micoplasmi nell'industria farmaceutica
La contaminazione da micoplasmi è un problema diffuso e ricorrente riscontrato in molti tipi di colture cellulari, sia nell’ambito degli studi life science che dell’industria farmaceutica. I micoplasmi possono proliferare nei terreni di coltura, raggiungendo titoli elevati senza provocare alcuno dei tipici sintomi di contaminazione batterica, come la torbidità. I loro effetti sulle cellule in coltura includono l’alterazione del metabolismo, il rallentamento della proliferazione e la comparsa di aberrazioni cromosomiche. In breve, la contaminazione da micoplasmi nelle linee cellulari interessate compromette la validità dei dati e dei risultati ottenuti negli studi di life science. Per questi motivi, i saggi per la ricerca dei micoplasmi così come il mantenimento di colture esenti da micoplasmi sono prassi fondamentali per le ricerche basate sulle colture cellulari e per i settori produttivi in cui la salute del consumatore è una delle preoccupazioni principali.
Il batterio Mycoplasma
I micoplasmi, i più piccoli tra i batteri conosciuti in quanto in grado di attraversare filtri con pori del diametro di 0,2 µm, crescono in condizioni aerobiche o anaerobiche facoltative.
I micoplasmi possono essere parassiti o saprofiti. Molte specie, per esempio M. pneumoniae, sono patogeni che causano polmoniti e altri disturbi respiratori nell’uomo. M. genitalium è probabilmente coinvolto nelle malattie infiammatorie della pelvi. Essendo batteri privi di parete cellulare, i micoplasmi non sono sensibili alle penicilline o ad altri antibiotici che agiscono su questa struttura. Per stabilizzare la loro membrana citoplasmatica, la maggioranza dei micoplasmi richiede steroli, che ottengono dall’ambiente, solitamente dal colesterolo dei loro animali ospiti. Molti ceppi di micoplasmi tollerano anche diversi altri antibiotici.
Fonti di contaminazione da micoplasmi
Le fonti di contaminazione da micoplasmi in laboratorio e nelle aree di produzione sono molto difficili da controllare. Alcune specie sono presenti sulla pelle umana e possono essere introdotte nelle colture in seguito all'adozione di tecniche asettiche inadeguate. Inoltre, i micoplasmi possono essere introdotti tramite supplementi contaminati, come il siero fetale bovino, o più comunemente mediante trasmissione da altre colture cellulari contaminate. Una volta che hanno popolato una coltura cellulare, possono diffondersi rapidamente per aerosol e attraverso particelle generate durante la manipolazione della coltura, contaminando altre aree del laboratorio. Per un controllo efficace della contaminazione da micoplasmi nelle aree di produzione è quindi fondamentale attenersi scrupolosamente alle buone pratiche asettiche di laboratorio, così come è vivamente raccomandata l’esecuzione di routine dei relativi saggi sulle colture.
Perché nell'industria farmaceutica si devono eseguire i saggi per la ricerca dei micoplasmi?
Gli impianti biofarmaceutici che si avvalgono di cellule eucariote per la produzione dei vaccini devono testare le loro banche cellulari e i lotti degli inoculi virali, oltre ai vaccini in bulk, per escludere la contaminazione da micoplasmi. Le specie di questo genere di batteri infettano le cellule eucariote, compromettendone la crescita e il metabolismo. Quando i micoplasmi interferiscono con il processo di produzione dei vaccini, possono avere effetti sulla qualità delle proteine e sulla produttività e, fattore più importante, possono causare eventi indesiderati nei pazienti destinatari del prodotto vaccinale finale.
La contaminazione del bioreattore con micoplasmi può causare significative perdite di tempo, materiali e ricavi, a meno che non venga identificata tempestivamente nel processo produttivo. In assenza di rigorosi saggi standardizzati, la contaminazione dei lotti di produzione biofarmaceutica da parte dei micoplasmi è estremamente difficile da scoprire perché la loro presenza generalmente non determina un cambio del pH, né variazioni visibili della torbidità del terreno di coltura. Nella Farmacopea, il metodo per la ricerca dei micoplasmi prevede l’esecuzione di saggi sia su cellule in coltura, sia su cellule indicatrici. Se si usano solo due terreni per l’analisi, si raccomanda di usare in combinazione i terreni FREY e FRIIS.
Metodi per la ricerca dei micoplasmi
È importante che biofarmaci, vaccini, colture cellulari e colture virali vengano testati per i micoplasmi in diverse fasi del controllo della qualità. Le tre metodiche più comunemente utilizzate sono:
- coltura dei micoplasmi, in cui dei terreni per colture batteriche ottimizzati per i micoplasmi vengono inoculati con i campioni in esame
- metodi di colorazione del DNA, in cui i nuclei dei micoplasmi vengono controcolorati con Hoechst o DAPI e analizzati mediante microscopia a fluorescenza
- PCR (reazione a catena della polimerasi), che amplifica il DNA batterico nel caso i micoplasmi siano presenti nei campioni di coltura
Procedura per la ricerca dei micoplasmi in conformità alla Farmacopea Europea 2.6.7 e all’USP 63
* Nei giorni successivi all’inoculazione, effettuare una sottocoltura di ciascun terreno liquido mediante inoculazione di 0,2 ml in almeno una piastra di ciascun terreno di coltura solido Ripetere la procedura tra il sesto e l’ottavo giorno, di nuovo tra il tredicesimo e il quindicesimo giorno, poi tra il diciannovesimo e il ventunesimo giorno del saggio. Osservare i terreni di coltura liquidi ogni 2 o 3 giorni e, se si verifica un qualsiasi cambiamento di colore, allestire una sottocoltura.
N.B.: includere inoltre un controllo positivo e un controllo negativo per ogni terreno di coltura liquido e solido, incubandoli per 14 giorni.
Terreni pronti all'uso per la ricerca dei micoplasmi secondo farmacopea
Offriamo un assortimento completo di terreni di coltura liquidi e solidi pronti all’uso per la ricerca dei micoplasmi conformi alla Farmacopea Europea 6.1 (2.6.7.) e all’USP 35 (63). Senza nessuna ulteriore fase di preparazione, i nostri terreni di coltura per micoplasmi pronti all’uso assicurano una qualità costante e una tracciabilità completa del prodotto con certificati di analisi lotto-specifici.
Per via dei loro ingredienti, solitamente i terreni per micoplasmi durano meno rispetto alla maggior parte degli altri terreni di coltura per il controllo della qualità microbiologica. La durata dei nostri terreni pronti all’uso liquidi e solidi Friis, Frey e Hayflick è stata prolungata a 4 mesi per le piastre agarizzate e a 6 mesi per i brodi. Scopri la nostra gamma completa di terreni di coltura pronti all’uso che durano più a lungo per facilitare la ricerca dei micoplasmi.
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