HPLC di grandi molecole

HPLC a fase inversa di biomolecole

L'HPLC a fase inversa (RP-HPLC) è una tecnica sensibile e versatile impiegata per separare e analizzare proteine, frammenti proteici e peptidi. Nella RP-HPLC, la fase stazionaria è apolare, mentre la fase mobile è polare. La ritenzione di proteine e peptidi sulla fase stazionaria segue i principi dell’adsorbimento e della partizione. Le regioni idrofobiche delle proteine si legano reversibilmente alla fase stazionaria. Queste molecole vengono poi eluite aumentando la apolarità della fase mobile. La risoluzione è influenzata dalle dimensioni delle particelle e quelle dei pori, dalla lunghezza della colonna e dalla catena idrocarburica legata al supporto solido della fase stazionaria.

Cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC)

La cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) è una tecnica cromatografica non-denaturante che consente di separare le molecole in base alla loro dimensione (ossia secondo il raggio idrodinamico). Questa modalità non si basa sulla interazione dell’analita con la fase stazionaria, bensì sul flusso casuale dell’analita attraverso le particelle della fase stazionaria. Gli analiti ad alto peso molecolare sono eluiti per primi perché vengono esclusi del tutto o parzialmente dai pori delle particelle della fase stazionaria, mentre gli analiti di minor peso molecolare eluiscono dopo perché impiegano più tempo ad attraversare il percorso tortuoso tra le particelle. La SEC viene usata per caratterizzare aggregati e frammenti di anticorpi monoclonali (mAb), per determinare pesi molecolari incogniti delle proteine e per determinare la stabilità di formulazioni proteiche.

Cromatografia per interazione idrofobica (HIC)

La cromatografia per interazione idrofobica (HIC) è una tecnica cromatografica che separa gli analiti in base al grado di interazione tra i gruppi idrofobi dell’analita e i ligandi della fase stazionaria idrofoba. La HIC non viene comunemente usata per separare i peptidi, a causa del loro minore peso molecolare e della minore tendenza al ripiegamento. Alte concentrazioni saline riescono a disgregare gli strati di idratazione e ad esporre le regioni superficiali idrofobe delle proteine, che possono così interagire con la fase stazionaria apolare. Per la scelta del sale si ricorre alla serie di Hofmeister che classifica cationi e anioni in base alla loro capacità di attaccare gli strati di idratazione delle proteine (caotropici) o di promuoverne la formazione (cosmotropici). Sali tipicamente utilizzati sono il solfato di ammonio, il solfato di potassio e il solfato di sodio. La cromatografia per interazione idrofobica è attualmente impiegata per determinare il profilo del rapporto farmaco-anticorpo (DAR) dei coniugati farmaco-anticorpo (ADC).

Cromatografia a scambio ionico (IEX)

La cromatografia a scambio ionico (IEX) è una tecnica cromatografica che permette di separare gli analiti a seconda della loro carica. Proteine e peptidi sono composti anfoteri, cioè esibiscono sia un comportamento acido, sia basico. Gruppi funzionali acidi delle proteine includono l’acido aspartico, l’acido glutammico, la cisteina, la tirosina e l'α-carbossilato C-terminale. I gruppi funzionali basici includono l’arginina, l’istidina, la lisina e il gruppo α-amminico N-terminale. Con la IEX è possibile rilevare e risolvere varianti di carica di biofarmaci. Le varianti di carica possono essere causate da un'errata traduzione dell'RNA messaggero (mRNA) e/o da modifiche post-traduzionali come deammidazione, ossidazione o glicosilazione.

La colonna per IEX deve essere scelta in base al punto isoelettrico (pI) dell’analita. Se il pH della fase mobile è inferiore al pI, l’analita si caricherà positivamente e si legherà a una colonna a scambio cationico. Se il pH della fase mobile è più alto del pI, l’analita si caricherà negativamente e si legherà a una colonna a scambio anionico.

Cromatografia d'affinità

La cromatografia d'affinità si basa su un'interazione specifica fra un analita e un ligando della fase stazionaria. Idealmente soltanto l’analita di interesse interagisce con la fase stazionaria, mentre tutti gli altri componenti del campione passano attraverso la colonna. In seguito, si fa passare una seconda fase mobile attraverso la colonna per eluire l’analita.

La cromatografia con proteina A è la forma più comune di cromatografia d'affinità impiegata nell’industria biofarmaceutica. La proteina A è una proteina di superficie di 42 kDa della parete cellulare dello S. aureus. Essa si lega specificamente alla catena pesante nella regione Fc delle IgG il che la rende ideale per separare le IgG da altri componenti del campione. La maggior parte delle colonne a Proteina A sono prodotte immobilizzando questa proteina su particelle porose di natura organica. Tuttavia, esistono anche colonne monolitiche per cromatografia con Proteina A che assicurano alte produttività in un ampio intervallo di flussi, senza sacrificare l’efficienza.

In evidenza