HPLC di piccole molecole

La possibilità di ottenere i migliori risultati possibili nell'analisi di piccole molecole mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), UHPLC o LC-MS dipende dalla scelta della fase stazionaria e delle condizioni della fase mobile più adatte. Per scegliere la chimica della colonna più adatta, è importante tener conto della chimica dell’analita. Altri fattori come la velocità del flusso, la matrice e il numero di componenti del campione concorrono a individuare il substrato più adatto per la fase stazionaria.

HPLC di piccole molecole

L’analisi HPLC di piccole molecole molto spesso è condotta nella modalità di separazione detta "fase inversa". Per separare composti polari, sono adatte anche la cromatografia a interazione idrofilica (HILIC) e la cromatografia in fase normale, anche se la HILIC è il metodo preferito. Per la separazione di composti ionici si può ricorrere a tecniche di scambio ionico e per gli anioni o i cationi inorganici si può utilizzare anche la cromatografia ionica.

Le colonne per HPLC possono essere impaccate con particelle di silice totalmente porose o con particelle di silice porose solo in superficie o, ancora, con particelle polimeriche, oppure possono essere formate da una barra di silice monolitica che costituisce la fase stazionaria. Si usano anche particelle di allumina, zirconia e carbone. Le dimensioni dei pori del materiale della fase stazionaria per la separazione di piccole molecole si situano tipicamente nell’intervallo fra 60 Å - 160 Å. In HPLC, le dimensioni delle particelle della fase stazionaria sono generalmente comprese tra 3 e 5 µm. In UHPLC si impiegano particelle più piccole, dell’ordine di 2 µm o anche meno. La fase stazionaria può essere soggetta a diverse modificazioni. Nella cromatografia a fase inversa (RP), una catena alchilica C18 è la funzionalizzazione più usata. Tuttavia, la disponibilità di altre modificazioni come C30, C8, fenil, pentafluorofenil, di una vasta gamma di funzionalizzazioni più polari, ma anche di modificazioni per lo scambio ionico o di funzionalizzazioni chirali consente di separare quasi tutti i composti solubili in liquidi. La fase mobile per la cromatografia RP-HPLC è tipicamente costituita da un tampone acquoso o acqua con solventi organici miscibili con acqua, come acetonitrile o metanolo.

Preparazione del campione per HPLC

Campioni complessi e ricchi di matrice, come alimenti, bevande, cosmetici, campioni biologici e formulazioni farmaceutiche (es. creme, sciroppi) richiedono efficienti protocolli di preparazione del campione per eliminare i componenti indesiderati ed estrarre selettivamente l’analita di interesse. Questo è un fattore cruciale quando la fase stazionaria è costituita da particelle con dimensioni molto piccole, come nell'UHPLC, in cui vengono impiegate particelle di 2 µm o anche più piccole. Metodi comuni per la preparazione dei campioni sono l’estrazione liquido-liquido, l’estrazione in fase solida (SPE) e, nel caso di campioni biologici, anche la precipitazione di proteine insieme alla filtrazione. Oltre all’eluizione selettiva del composto di interesse e alla pre-concentrazione, lo scopo principale della preparazione del campione è la protezione della fase stazionaria per HPLC da ostruzioni causate dalla matrice del campione. Le colonne per HPLC in silice monolitica possono tollerare meglio le matrici e richiedono una minore preparazione del campione rispetto alle colonne costituite da particelle.

Derivatizzazione

Alcune molecole devono essere derivatizzate prima (pre-colonna) o dopo (post-colonna) la separazione HPLC. Ci si avvale della derivatizzazione per migliorare la sensibilità o la ritenzione cromatografica nell'analisi HPLC. Per la derivatizzazione, si impiegano reagenti chimici aventi le proprietà chimiche e fisiche opportune.

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