Analisi cliniche e forensi
Le analisi cliniche assicurano un contributo essenziale in termini di informazioni cliniche di rilievo in grado di influire sulle decisioni terapeutiche. I saggi diagnostici utilizzati dai laboratori di analisi cliniche possono essere distinti in due tipologie principali: i saggi diagnostici in vitro (IVD) e i test sviluppati in laboratorio (LDT). Questi saggi esamineranno un’ampia gamma di analiti in una diversificata serie di campioni di origine umana, fornendo informazioni importanti dal punto di vista diagnostico. I laboratori clinici si occupano anche dello screening di farmaci, del monitoraggio terapeutico e dell’identificazione di sostanze d’abuso. Le analisi forensi solitamente rispondono alle esigenze del sistema giudiziario venendo effettuate nell’ambito di indagini e di procedure legali.
Alcune tra le modalità analitiche più importanti sono i saggi immunologici, come l’ELISA e l’immunoistochimica (IHC), le tecniche di diagnostica molecolare, come PCR, qPCR e sequenziamento e tecniche di chimica analitica, come la cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS).
- Il ruolo dei test sviluppati in laboratorio (LDT) nelle analisi dei laboratori di diagnostica clinica
- Test sviluppati in laboratorio (LDT): modalità analitiche e tipologie di campione più comuni
- Monitoraggio terapeutico dei farmaci
- Dosaggio delle sostanze d’abuso: tipologie di campioni/ test e modalità analitiche
- Tossicologia: applicazioni nelle analisi cliniche e forensi
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I test LDT costituiscono una parte cruciale, ma solitamente limitata, di tutti i test eseguiti da un laboratorio clinico; essi completano l’offerta più consistente dei test diagnostici in vitro.
Solitamente i test LDT colmano una lacuna del mercato dei test clinici non soddisfatta dai test IVD disponibili, oppure forniscono un valore aggiunto rispetto agli IVD corrispondenti. Talvolta, essi coprono esigenze analitiche “esoteriche” legate a condizioni piuttosto rare per cui non c’è interesse commerciale a sviluppare degli IVD. In altri casi, gli LDT consentono di rispondere rapidamente a malattie infettive emergenti, come si è visto con la pandemia di SARS-CoV-2 (COVID-19).
Una delle distinzioni rilevanti tra LDT e IVD sta nel fatto che sono i singoli laboratori ad assumersi la responsabilità di sviluppare e utilizzare i saggi LDT, il che conferisce loro tutta la flessibilità e l’agilità necessarie per soddisfare esigenze ancora senza risposta.
Gli LDT possono servirsi di un’ampia gamma di modalità analitiche, ma le più comuni sono la cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS), tecniche di diagnostica molecolare (Mdx) come la PCR quantitativa (qPCR) e il sequenziamento NextGen (NGS) e gli approcci immunologici (IA) come i saggi di immunoadsorbimento enzimatico (ELISA).
Tra i campioni di origine umana più comunemente analizzati ci sono il sangue e le urine per le analisi di routine, i capelli e la saliva per obiettivi specifici, ad esempio lo screening farmacologico.
Il monitoraggio terapeutico dei farmaci svolge un ruolo importante nell’assicurare la compliance e/o la sicurezza del paziente in un sottoinsieme di programmi di cure critiche. Un esempio può essere quello delle analisi destinate ad assicurare che i livelli di farmaco usati per il trattamento siano sicuri ed efficaci. Esempi di farmaci che possono essere monitorati sono:
- antibiotici
- terapie per il cuore
- entiepilettici
- farmaci per la cura delle malattie autoimmuni
- farmaci per il disturbo bipolare
Il monitoraggio terapeutico è previsto negli approcci clinici alla terapia del dolore per assicurare la compliance del programma di trattamento e per limitare il rischio di abuso con medicinali come, ad esempio, gli oppioidi.
Il dosaggio delle sostanze d’abuso consente di rilevare la presenza di droghe illecite o un uso inadeguato di medicinali soggetti a prescrizione medica; viene effettuato a tutela della sicurezza del paziente, per motivi legali e/o in riferimento alle condizioni di impiego del personale. Le sostanze più comunemente cercate sono:
- anfetamine: metanfetamina, anfetamina
- barbiturici: fenobarbital, secobarbital, pentobarbital, butalbital, amobarbital
- benzodiazepine: diazepam, lorazepam, oxazepam, temazepam, alprazolam
- cannabinoidi: marijuana
- cocaina: cocaina e/o suoi metaboliti (benzoilecgonina)
- metadone: metadone, il suo metabolita EDDP
- oppioidi: codeina, morfina, metaboliti dell’eroina, ossicodone, ossimorfone, idrocodone, idromorfone
- fenciclidina: PCP
L'approccio più comune prevede uno screening delle urine e un’analisi del sangue di conferma.
La tossicologia si occupa del monitoraggio terapeutico dei farmaci e del dosaggio di sostanze d’abuso nei laboratori clinici, ma anche delle operazioni svolte sulla scena del crimine e delle attività investigative da parte dei laboratori forensi. Benché i campioni per le analisi forensi siano più diversificati per quanto riguarda la loro origine, molte delle tecniche analitiche sono simili tra loro e dipendono dagli analiti cercati.
Nella LC-MS, il flusso operativo inizia con la raccolta dei campioni e può comprendere una fase di preparazione dei campioni prima della separazione, della rivelazione e della quantificazione. La preparazione dei campioni può includere trattamenti enzimatici, la purificazione mediante filtrazione, l’arricchimento, oppure altri passaggi di purificazione. La separazione del campione avviene nel corso della cromatografia liquida (LC); poi l’analita viene rilevato e quantificato con la spettrometria di massa (MS). La taratura dello strumento e il confronto dell’analita con standard opportuni è un elemento essenziale di questo processo. Materiali di riferimento certificati e standard analitici rivestono un ruolo cruciale nel flusso operativo delle analisi in LC-MS.
Le analisi in LC-MS sono ampiamente utilizzate per svariati motivi, tra i quali:
- monitoraggio terapeutico dei farmaci
- dosaggio di sostanze d’abuso
- analisi metaboliche
- dosaggi ormonali
- dosaggi di vitamine
- screening neonatale
Esempi di materiali usati in ciascuna fase:
- raccolta e preparazione dei campioni
- unità filtranti
- provette per analisi
- enzimi – beta-glucuronidasi
- puntali, piastre e colonnine per estrazione in fase solida (SPE)
- fibre per microestrazione in fase solida (SPME)
- separazione del campione
- colonne e accessori per HPLC
- solventi per HPLC
- reagenti per cromatografia
- rilevazione e quantificazione del campione
- materiali di riferimento certificati
- standard analitici
Nella PCR, il flusso operativo inizia con la raccolta del campione e può comprendere una fase di purificazione, seguita dalla specifica amplificazione di un DNA/RNA target. Nel caso della qPCR, la quantificazione avviene in tempo reale durante i cicli di amplificazione. La qPCR è talvolta detta, per questo, RT-PCR (RT= real time). L’alternativa è la PCR end point in cui i risultati vengono determinati una volta conclusi i cicli di amplificazione.
La PCR a scopo analitico può essere utilizzata ogni volta in cui è opportuno raccogliere informazioni circa la presenza, la lunghezza o la sequenza di DNA o RNA. Ad esempio:
- screening e identificazione di malattie infettive
- screening genetico
- oncologia
- analisi prenatali
Materiali fondamentali per la PCR sono:
- purificazione del campione
- kit e reagenti per la purificazione degli acidi nucleici (NAP)
- amplificazione del campione
- oligo, primer, sonde
- enzimi per l’amplificazione del DNA (es. Taq)
- enzimi per la trascrizione inversa (RT)
- reagenti per la reazione di amplificazione tra i quali tamponi, sali e nucleotidi (dNTP)
Il saggio ELISA (immunoadsorbimento enzimatico) è una tecnica immunologica molto diffusa che consente lo screening ad alto rendimento e la quantificazione di anticorpi, proteine, peptidi e di piccole molecole.
L’ELISA trova impiego anche in un’ampia gamma di applicazioni analitiche quali:
- oncologia
- malattie infettive
- screening di sostanze d’abuso
- dosaggi ormonali
- funzione immunitaria/ immunologia
I saggi ELISA vengono solitamente effettuati in piastre, di cui quelle a 96 pozzetti sono le più comuni. Queste piastre possono essere fornite pronte all’uso (IVD), oppure preparate in proprio (LDT). I prodotti più comunemente impiegati per preparare una piastra per ELISA in modalità “sandwich” sono:
- piastra per ELISA
- anticorpo di cattura
- reagenti di bloccaggio, come BSA, caseina, ecc.
- tamponi di lavaggio
Una volta preparata la piastra, i materiali solitamente usati per le fasi successive saranno:
- preparazione del campione
- reagenti di lisi
- tamponi
- detergenti
- inibitori delle proteasi
- binding del campione/lavaggio
- tamponi, ad es. PBS, PBS-T
- rilevazione
- anticorpi primari contro l’analita di interesse
- anticorpi secondari/ anticorpi coniugati, ad esempio con fosfatasi alcalina (AP) o perossidasi di rafano (HRP)
- reagenti per la rilevazione con gli anticorpi coniugati, ad es. TMB, OPD, pNPP e perossido di idrogeno
- reagente di arresto
Flusso operativo della LC-MS
Preparazione dei campioni
Una efficace preparazione dei campioni è decisiva per analisi accurate ed efficienti. Migliora le tue analisi e proteggi i tuoi strumenti concentrando e purificando i tuoi campioni.
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Standardizzazione e taratura
I materiali di riferimento sono un elemento cruciale nei flussi operativi delle determinazioni analitiche e nelle più ampie strategie di assicurazione della qualità. Qualifica e tara i tuoi strumenti e i tuoi saggi.
- Prodotti farmaceutici
- Sostanze d’abuso
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- Biomarcatori
Separazione e analisi cromatografica
Colonne, solventi, reagenti ed accessori influenzano significativamente accuratezza, affidabilità ed efficienza delle analisi. Sfrutta al meglio le risorse tecniche disponibili per ottimizzare il tuo approccio.
- Solventi
- Colonne e accessori per HPLC
- Reagenti per spettroscopia
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