Espressione di proteine

I progressi raggiunti nella genomica, nei clonaggi e in varie tecniche di biologia molecolare fanno si che i ricercatori possano oggi esprimere delle proteine eterologhe in numerosi sistemi biologici. La capacità di esprimere proteine​ricombinanti fornisce ai ricercatori l’accesso a una vasta gamma di applicazioni a valle, fondamentali per proseguire gli studi di ricerca. La sovraespressione di proteine su piccola scala è utilizzata negli studi di analisi della funzione proteica; mentre la produzione su larga scala è essenziale per la produzione di enzimi, anticorpi e vaccini. Indipendentemente dal processo produttivo e dalla quantità di proteina prodotta, risulta comunque critica la determinazione delle condizioni ottimali per la crescita cellulare e per l’espressione delle proteine. Il tipo di sistema di espressione prescelto, sia esso procariotico o, nel caso siano richieste delle modifiche post-traduzionali, eucariotico, determinerà in gran parte quali strumenti e reagenti sono necessari per un'espressione proteica ottimale.

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Vettori d'espressione

I vettori di espressione o plasmidi sono sequenze circolari di DNA comunemente utilizzate dai ricercatori come strumento per ospitare il gene che codifica la proteina di interesse. I plasmidi contenenti il gene di interesse vengono introdotti nelle cellule mediante trasformazione o trasfezione, per sovraesprimere la proteina, I plasmidi contengono vari elementi che servono a facilitare il clonaggio, la selezione dei cloni, l'espressione e la purificazione delle proteine. Tali elementi comprendono, tra gli altri, un sito di clonaggio multiplo (MCS), dei geni per la resistenza agli antibiotici utilizzati per la selezione dei cloni, delle etichette (tag) che consentono l’identificazione e la purificazione delle proteine, nonché delle regioni con dei promotori forti per guidare l'espressione proteica. Molti di questi elementi sono intercambiabili ed esiste un'ampia varietà di vettori di espressione, a seconda delle esigenze applicative e del tipo di cellula utilizzato.

Sistemi di espressione di proteine in cellule batteriche, di mammifero ed altro

Viste le rapide cinetiche di crescita e la velocità della trasformazione in E. coli, i batteri costituiscono il cavallo di battaglia per la produzione di proteine ricombinanti. L'espressione delle proteine batteriche si basa sulle subunità ribosomiali 30S e 50S del ribosoma batterico 70S. Per prevenire la crescita delle cellule prive di plasmidi, si utilizzano plasmidi contenenti geni che esprimono la resistenza ad antibiotici per poter identificare e isolare solamente i batteri che hanno incorporato il plasmide contenente la sequenza che codifica per la proteina di interesse. Per eliminare i batteri privi di plasmidi vengono utilizzati diversi tipi antibiotici che agiscono bloccando la sintesi proteica; la conferma definitiva della presenza della sequenza genica d’interesse è comunque spesso affidata al sequenziamento genetico. Oltre ai batteri, vengono comunemente utilizzati anche altri sistemi di espressione come lieviti, cellule di insetto e cellule di mammifero. A differenza dei batteri, le linee cellulari eucariotiche contengono meccanismi molecolari in grado di introdurre delle modifiche post-traduzionali (ad esempio la glicosilazione) che sono spesso essenziali per garantire la funzionalità delle proteine e la significatività delle successive analisi.

Applicazioni dell’espressione di proteine​ricombinanti

Le proteine​ricombinanti codificate dal plasmide di espressione possono essere modificate al fine di ottimizzare la resa di espressione/purificazione​oppure vengo mutate per eseguire degli studi funzionali. La capacità di aggiungere, rimuovere o alterare la sequenza codificante la proteina anche in un singolo nucleotide, fornisce ai ricercatori uno strumento immensamente potente per indagare su una grande varietà di questioni della ricerca di base e chiarire la funzione della proteina sia nei tessuti sani che in quelli patologici . Le implicazioni della tecnologia di espressione delle proteine ricombinanti si estendono ben oltre le applicazioni della ricerca di base e sono essenziali per lo sviluppo di terapie e vaccini salvavita.