Citometria a flusso
La citometria a flusso è una tecnica che utilizza laser singoli o multipli per fornire un'analisi multiparametrica di singole cellule. Ogni cellula o particella viene analizzata in base alla capacità di deviare la luce (light scattering) o la fluorescenza mentre passa rapidamente davanti ai laser. La fluorescenza può essere ottenuta grazie alla trasfezione ed espressione di proteine fluorescenti (ad es. Green Fluorescent Protein, GFP) e mediante marcatura con anticorpi coniugati fluorescenti o con coloranti fluorescenti. La citometria a flusso è una tecnica potente comunemente utilizzata in applicazioni di biologia molecolare e cellulare, tra cui immunologia, biologia dei tumori e ricerca sulle malattie.
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Anticorpi e marcatori per citometria a flusso
Un'analisi in citometria a flusso richiede l'impiego di diversi anticorpi e marcatori per citometria. Nella citometria a flusso, gli anticorpi si legano in maniera specifica a diversi marcatori cellulari, contribuendo a caratterizzare le cellule e a valutare eventuali mutazioni dell'espressione proteica nell'ambito dell'esperimento. Per la visualizzazione degli anticorpi in applicazioni di citometria a flusso sono disponibili numerosi marcatori, tra i quali coloranti per gli acidi nucleici, coloranti per l’analisi della vitalità cellulare, coloranti polimerici, punti quantici, piccole molecole organiche e proteine fluorescenti. Gli anticorpi sono normalmente marcati tramite coniugazione diretta (in commercio sono disponibili sia anticorpi coniugati, sia kit di coniugazione che consentono all'utente finale di effettuare la coniugazione) o grazie all'impiego di un anticorpo secondario. Una nuova tecnologia proprietaria consente di accoppiare in maniera estremamente versatile gli anticorpi e i cromofori preferiti in qualunque combinazione, senza dover ricorrere a kit di coniugazione o ad anticorpi secondari.
Applicazioni della citometria a flusso
La citometria a flusso viene utilizzata in numerosi settori e spesso analizza parametri diversi in diverse popolazioni di cellule. Le applicazioni più comuni nel campo della biologia molecolare includono l'analisi di proteine ricombinanti fluorescenti la cui espressione viene indotta in vari tipi cellulari per la comprensione della funzione genica o per analisi di cell tracking in vivo. La colorazione del DNA consente l'analisi del ciclo cellulare, mentre l'uso di anticorpi rende possibili un'ampia gamma di analisi tra cui l’analisi di trasduzione del segnale, RNA ed espressione proteica. Una delle applicazioni più comunemente utilizzate della citometria a flusso è l’immunofenotipizzazione. Nella immunofenotipizzazione degli anticorpi coniugati con un fluorocromo riconoscono più antigeni sulla superficie delle cellule consentendo l'identificazione di specifiche cellule immunitarie all'interno di una popolazione.
Analisi dei dati di citometria a flusso
L'analisi dei dati di citometria a flusso spesso comporta l'identificazione di una regione specifica di cellule o cluster, l’uso di parametri sperimentali aggiuntivi e la ricerca di ulteriori fattori di identificazione per ottenere ulteriori informazioni sull'identità cellulare. Numerosi sono i programmi di software che vengono usati per facilitare questo tipo di analisi e per altre analisi sul ciclo cellulare.
Strumenti per citometria a flusso
Panoramica dei principali componenti del citometro a flusso: il sistema elettronico, il sistema ottico e il sistema fluidico. La fluidica funge da sistema di erogazione del liquido per indirizzare il campione ai componenti ottici, costituiti dall'ottica di eccitazione (laser) e da fotodiodi e tubi fotomoltiplicatori (PMT). I componenti elettronici convertono le informazioni dei sensori in segnali digitali che vengono interpretati dai computer. E’ possibile usare combinazioni di sistemi diversi per un’analisi più avanzata del campione, incluso l'uso di cell sorter per purificare e raccogliere campioni e di citometri per imaging per combinare la citometria a flusso con la microscopia a fluorescenza.
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