Pull-down di proteine
Il saggio di pull-down è progettato per determinare l'interazione tra due o più proteine. Nel pull-down, alla proteina di interesse detta “esca” (bait) viene aggiunto un tag, l’esca è quindi catturata mediante un legame covalente da un ligando immobilizzato su biglie, in alternativa l’esca è legata per affinità a ioni metallici, come nella cromatografia IMAC. I tag più comunemente usati per le esche sono la glutatione S-transferasi (GST) e l'istidina. La proteina esca forma un complesso che è poi incubato con le proteine contenute in un lisato di cellule o tessuti. Dopo una serie di lavaggi, le proteine vengono eluite dalle biglie della resina e raccolte per centrifugazione. La tecnica del pull-down di affinità per la purificazione e rilevazione delle proteine si distingue dal saggio di immunoprecipitazione (IP) e dalla Co-IP in quanto non è basata sull’interazione antigene-anticorpo. Nei saggi di pull-down il campione purificato viene poi analizzato mediante SDS-PAGE, spettrometria di massa e Western blotting per ulteriori studi a valle.
Applicazioni del pull-down di affinità con GST
La glutatione S-transferasi (GST) è una proteina di 211 aminoacidi che si trova nella maggior parte degli organismi. La GST è spesso inserita nei vettori di espressione per consentire la produzione di proteine di fusione con tag GST in sistemi di espressione come di E. coli. Il tag-GST è un tag proteico di grandi dimensioni, circa 26 kDa, e può essere espresso in cellule di batteri, lieviti, mammiferi e insetti. L’uso di un tag GST è vantaggioso quando è necessario proteggere la proteina ricombinante dall’azione delle proteasi intracellulari o aumentarne la solubilità. Inoltre, la proteina-GST fornisce un tag ad alta affinità per la purificazione e per esperimenti di pull-down basati su resine di affinità poco costose e che richiedono blande condizioni di eluizione.
Co-immunoprecipitazione
Il saggio di pull-down è ideale per la verifica dei risultati della co-immunoprecipitazione ed è un eccellente metodo per identificare interazioni proteina-proteina sconosciute oltre che lo stato di attivazione di specifiche proteine. A differenza dei metodi di pull-down, basati sull’affinità, l'IP si basa sull’uso di anticorpi, per legare e isolare gli antigeni da campioni biologici complessi.
La Co-IP utilizza un anticorpo per legare un antigene all'interno di un complesso multiproteico. Il complesso viene quindi catturato con l'aggiunta di proteina A o proteina G. L'elevata affinità delle proteine A/G per la regione Fc degli anticorpi IgG policlonali e monoclonali le rende un componente critico nella purificazione di proteine o di complessi proteici di interesse. Il metodo del pull-down rappresenta uno strumento essenziale per lo studio delle reti di interazione proteina-proteina; tuttavia, la scelta del metodo specifico sarà determinata dalla specifica esigenza applicativa del ricercatore.
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