Concentrazione delle proteine & scambio di tampone
La concentrazione delle proteine e lo scambio di tampone sono metodiche comunemente utilizzate nella purificazione di proteine e anticorpi, nel bioprocesso e nell’analisi proteomica. La preparazione di campioni di macromolecole in soluzione (proteine, enzimi, anticorpi e virus) spesso dà origine a grandi volumi di proteine o di altre macromolecole diluite in tamponi incompatibili con le successive procedure analitiche o di bioprocesso. Dopo l'estrazione del campione, spesso è necessario procedere alla concentrazione e alla chiarifica delle proteine diluite, prima di poterle analizzare o utilizzare.
Concentrazione delle proteine
Esistono diverse metodiche per la concentrazione delle proteine, tra cui la filtrazione con membrane porose, la dialisi in soluzioni iperosmotiche e la precipitazione/salting out. Un metodo comodo è quello dell'ultrafiltrazione che utilizza membrane semipermeabili per concentrare le proteine applicando una pressione o una forza centrifuga, minimizzando nel contempo la denaturazione, la disattivazione e la degradazione proteica. In questa tecnica, il fluido in eccesso passa attraverso il filtro, mentre la proteina bersaglio viene trattenuta; diminuendo il volume del campione, la concentrazione della proteina aumenta.
Arricchimento proteico
Nell'arricchimento proteico, specifici gruppi o tipi di proteine presenti in un campione biologico vengono concentrati per l’analisi successiva. I metodi di arricchimento proteico vengono utilizzati per isolare proteinepoco abbondanti e ridurre la complessità del campione. L'arricchimento separa e concentra le proteine bersaglio per facilitare la successiva analisi proteomica. Spesso per l’arricchimento proteico si ricorre all'ultrafiltrazione che consente di separare le diverse classi di proteinein base al peso molecolare.
Scambio di tampone e desalazione
Le proteine purificate necessitano spesso di essere trasferite in un tampone che sia adatto alle analisi successive. Scambio del tampone, desalazione e rimozione dei detergenti possono essere eseguiti con vari metodi tra cui:
- dialisi: piccole molecole permeabili come sali, detergenti, solventi e altre impurezze vengono rimosse in base alla loro capacità di passare attraverso una membrana
- cromatografia su colonna: i sali vengono rimossi su colonne di gel filtrazione mediante esclusione dimensionale
- diafiltrazione: sali, detergenti e altre impurezze vengono rimossi in base alla loro dimensione molecolare utilizzando membrane porose da ultrafiltrazione e applicando una pressione o la forza centrifuga.
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