T4455

TEV-Protease

• Synonym(e): P1 protease, TEVp, Tobacco Etch Virus protease, rTEV
• UNSPSC-Code: 12352204
• NACRES: NA.54

Eigenschaften

• Biologische Quelle: microbial (Tobacco Etch virus)
• Qualitätsniveau: 200
• Rekombinant: expressed in E. coli
• Beschreibung: Contains both a histidine tag and a GST tag
• Form: solution
• Spezifische Aktivität: ≥3,000 units/mg protein
• Mol-Gew.: 27 kDa
• Methode(n): protein purification: suitable
• Eignung: suitable for purification of HIS tagged recombinant proteins
• Anwendung(en): genomic analysis
• Versandbedingung: wet ice
• Lagertemp.: −20°C

Beschreibung

Allgemeine Beschreibung

TEV-Protease hat eine katalytische (NIa)-Proteasedomäne, die einem Molekulargewicht von 27 kDa entspricht. Sie ist eindeutig mit hoher Spezifizität und bei niedriger Temperatur aktiv.

Tabakätzvirus (TEV)-Protease ist ein hilfreiches Instrument für das Entfernen von Fusion-Tags von rekombinanten Proteinen.

Anwendung

TEV-Protease wird bei der Entfernung von Histidin-Tags aus der rekombinanten mitogen-aktivierten Proteinkinase 14 (MAPK14), Connexin 43 (Cx43) c-terminalem Fragment und δ1-pyrrolin-5-carboxylat-Reduktase von Oryza sativa verwendet. Außerdem wird sie bei der Eluierung aufgereinigter Proteasome von humanen Leukämie-Zelllinien K562 eingesetzt.

Biochem./physiol. Wirkung

Die Tabakätzvirus (TEV)-Protease wird einer Autolyse unterzogen; allerdings sind TEV-Protease-Mutanten gegen die Autolyse resistent. Die bakterielle Expression einer rekombinanten TEV-Protease führt zu einer unbefriedigenden Ausbeute und einer geringeren Löslichkeit. Durch die Verwendung von grün fluoreszierenden Fusionsproteinen überwindet die TEV-Protease diese Leistungsdefizite und findet Anwendungsmöglichkeiten in der strukturellen Genomforschung.

Immobilisierte TEV-Protease auf Streptavidin-Agarose ist ein effizientes Mittel zur Fusionsproteinspaltung. TEV-Protease wurde auch in einer Studie zur Untersuchung der proteolytischen Prozessierung von nlrp1b für Inflammasom-Aktivität verwendet.

TEV-Protease weist die streng eingehaltene 7-Aminosäuren-Spaltungserkennungssequenz Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓Gly/Ser auf.

Leistungsmerkmale und Vorteile

Unter dem Aspekt einer verbesserten Stabilität und hochspezifischen Aktivität über einen breiten Temperaturbereich hinweg optimal entwickelt und aufgereinigt.

Physikalische Eigenschaften

Ein modifiziertes 52-kDa-TEV-Proteasekonstrukt, das für eine einfache Entfernung mit Glutathion oder dem His-Select^®-Affinitätsmedium sowohl GST- als auch His-Tags enthält.

TEV-Protease ist eine aufgebaute katalytische Domäne der NIa-Protease des Tabakätzvirus (Tobacco Etch Virus). TEV-Protease ist eine hochspezifische Cysteinprotease, die der Familie der C4-Peptidasen angehört.

Einheitendefinition

Eine Einheit der TEV-Protease spaltet >85 % von 3 μg des Kontrollsubstrats in einer Stunde bei einem pH-Wert von 8,0 und einer Temperatur von 30 °C.

Physikalische Form

Lieferung als >=2 mg/ml in 25 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 1 mM TCEP und 50 % Glycerin

wässrige Glycerinlösung

Angaben zur Herstellung

Spaltungsprotokoll
Einen frischen Dialysepuffer herstellen. Der Dialysepuffer sollte unter dem Aspekt der Zielprotein-Löslichkeit optimiert werden und keine Protease-Inhibitoren enthalten. Außerdem sollte der Dialysepuffer mit nachgelagerten Aufreinigungsprozessen kompatibel sein, d. h. die Menge von EDTA oder DTT muss minimal sein, wenn eine HIS Select^®-Säule zum Entfernen des gespaltenen His-Tags verwendet werden soll.
Beispiel eines geeigneten Dialysepuffers: 25 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 - 500 mM NaCl, 14 mM β-Mercaptoethanol
Die Aktivität dieser TEV-Protease ist sowohl in 150 mM NaCl als auch in 500 mM NaCl und 400 mM Imidazol jeweils gleich.
Die Zielproteinprobe mit Dialysepuffer auf 1 - 2 mg/ml verdünnen. Falls sich das Zielprotein im Dialysepuffer aggregiert, ist dieser Schritt optional. Ein kleines Aliquot als Kontrolle für die PAGE-Analyse aufbewahren. EDTA kann bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben werden, wenn das Zielprotein von der HIS Select^™-Säule eluiert werden soll und EDTA mit dem Zielprotein kompatibel ist.
TEV-Protease in einem Protease-zu-Zielprotein-Verhältnis von 1:100 (w/w) bzw. 10.000 Einheiten (1 mg) TEV-Protease zu 100 mg Zielprotein zugeben. Das Molverhältnis muss nicht berechnet werden. TEV-Protease kann dem Zielprotein direkt zugegeben werden. Weder muss der Puffer geändert noch die TEV-Protease verdünnt werden. Das optimale Verhältnis sollte empirisch ermittelt werden. Ein Protease-zu-Zielprotein-Verhältnis (w/w) von 1:50 bis 1:200 sollte einen wirkungsvollen Bereich für die meisten Zielproteine ermöglichen.
Bei 4 °C ~ 16 Stunden lang gegen den Dialysepuffer dialysieren. Die Dialyse soll Imidazol oder Glutathion entfernen, wenn HIS Select^®- oder Glutathion-Affinitätssäulen zum Entfernen des gespaltenen Tags oder der TEV-Protease nach der Spaltung verwendet werden.
Normalerweise spaltet 1 mg TEV-Protease >90 % von 100 mg eines Kontrollproteins bei 4 °C binnen 16 Stunden.

Rechtliche Hinweise

HIS-Select is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

HiScreen is a trademark of Cytiva

Sicherheitshinweise

• Lagerklassenschlüssel: 10 - Combustible liquids
• WGK: WGK 2
• Flammpunkt (°F): Not applicable
• Flammpunkt (°C): Not applicable