Testy aktywności enzymów

Rysunek 1. Przedstawienie procesu oznaczania aktywności enzymatycznej rozpoczynającego się od donora fluorescencji i akceptora wygaszania na substracie przechodzącym przez enzymatyczne rozszczepienie w celu usunięcia wygaszacza, pokazujące wzrost aktywności fluorescencyjnej, który sygnalizuje, że zachodzi aktywność enzymatyczna.

Analizy aktywności enzymatycznej są głównie wykonywane przez naukowców w celu identyfikacji obecności lub ilości określonego enzymu w organizmie, tkance lub próbce. Przykłady takich enzymów obejmują α-amylazę, katalazę, lakazę, peroksydazę, lizozym oraz enzymy reporterowe - fosfatazę alkaliczną i lucyferazę. Szeroko dostępne są różnorodne odczynniki i metodologie, które pozwalają na badanie specyficznych interakcji enzym-substrat. Wybór odpowiedniego rozwiązania zależy od czułości wymaganej przez badacza. Rozwiązania kolorymetryczne są przydatne do wykrywania, podczas gdy odczynniki oparte na fluorescencji lepiej nadają się do ilościowego określania aktywności enzymów.

Nagrodzone kategorie

Dyslokacja tkanek

Zasoby dotyczące dysocjacji tkanek i odłączania komórek, protokoły oraz kompleksowa oferta niezawodnych i szeroko scharakteryzowanych enzymów, w tym trypsyny, kolagenazy, papainy, nukleaz (DNazy i RNazy), hialuronidazy, elastazy i proteazy XIV.

Produkty w sklepie

Substraty i enzymy do detekcji

Substraty i enzymy mają kluczowe znaczenie w badaniach z zakresu nauk przyrodniczych, zarówno jako narzędzia, jak i cele w systemach detekcji. Odkryj oparte na enzymach systemy wykrywania białek do testów ELISA, immunohistochemii, western blottingu i wielu innych, korzystając z naszego zróżnicowanego portfolio substratów i enzymów do wykrywania.

Produkty w sklepie

Enzymy do analizy leków

Enzymy do analizy leków, w tym β-glukuronidaza (beta-glukuronidaza) i sulfataza do metabolizmu leków i badań przesiewowych leków

Produkty w sklepie

Koenzymy

Nasza oferta wysokiej jakości koenzymów niezawodnie ułatwia funkcjonowanie enzymów i katalizuje reakcje w zastosowaniach badawczych.

Produkty w sklepie

Przegląd

Powiązane artykuły i protokoły

Wsparcie

Określenie optymalnych warunków dla aktywności enzymatycznej

Chociaż w literaturze opisano wiele testów enzymatycznych, konieczne jest zmodyfikowanie tych procedur do unikalnych wymagań badanego enzymu. Specyficzna aktywność enzymu zależy od wielu czynników, w tym pH, temperatury, siły jonowej i stężenia wszystkich składników w teście. W warunkach takich jak pH, aktywność enzymu często przypomina krzywą dzwonową. Najwyższa aktywność przy określonym pH jest zgłaszana jako V_max, z malejącą aktywnością obserwowaną na obu końcach krzywej. Niektóre enzymy mogą wymagać dodatkowego uwzględnienia związków, które nie są bezpośrednio zaangażowane w reakcję, takich jak jony metali, detergenty i cząsteczki hydrofobowe.

Określenie optymalnych warunków dla aktywności enzymatycznej

Chociaż w literaturze opisano wiele testów enzymatycznych, konieczne jest zmodyfikowanie tych procedur do unikalnych wymagań badanego enzymu. Specyficzna aktywność enzymu zależy od wielu czynników, w tym pH, temperatury, siły jonowej i stężenia wszystkich składników w teście. W warunkach takich jak pH, aktywność enzymu często przypomina krzywą dzwonową. Najwyższa aktywność przy określonym pH jest zgłaszana jako V_max, z malejącą aktywnością obserwowaną na obu końcach krzywej. Niektóre enzymy mogą wymagać dodatkowego uwzględnienia związków, które nie są bezpośrednio zaangażowane w reakcję, takich jak jony metali, detergenty i cząsteczki hydrofobowe.

Składniki testu enzymatycznego

Dla wielu enzymów woda jest standardowym rozpuszczalnikiem, ponieważ jest to to samo środowisko wodne, które występuje w komórkach. Jednakże, rozpuszczalniki organiczne są stosowane w niektórych przypadkach, gdy enzymy lub składniki enzymów są nierozpuszczalne w wodzie. Dodatkowo, substraty i kofaktory, katalizatory reakcji enzymatycznych, są również krytycznymi składnikami w teście aktywności enzymatycznej. Substraty i kofaktory są często identyfikowane na podstawie ich funkcji w warunkach fizjologicznych. W związku z tym substraty i kofaktory wchodzą ze sobą w interakcje i mogą być wymagane przez wiele różnych enzymów. Bufory i jony są dodatkowymi krytycznymi elementami, które należy wziąć pod uwagę, ponieważ są one niezbędne do stabilizacji pH podczas testu i bezpośrednio wpływają na aktywność enzymu. Na przykład jedno- lub dwuwartościowe jony metali mogą być wymagane do katalitycznej aktywności kofaktorów w reakcji i są niezbędne do aktywności enzymu.

Performing an Enzyme Assay

Przygotowanie składników testu enzymatycznego jest praktycznym pierwszym krokiem. Ogólnie rzecz biorąc, korzystne jest przygotowanie dużej mieszaniny testowej, z wyłączeniem jednego składnika aktywującego, aby uniknąć błędu pipetowania, który jest nieodłączny podczas pipetowania małych objętości. Po przygotowaniu mieszaniny testowej badacze dodają do niej ostatni składnik aktywujący, aby zainicjować test aktywności. Wstępna obróbka enzymu polegająca na przechowywaniu go w niskich temperaturach i często z różnymi dodatkami chemicznymi lub białkowymi jest krytycznym czynnikiem zapewniającym stabilność enzymu i maksymalną aktywność przed rozpoczęciem testu. Po połączeniu materiałów reakcyjnych w naczyniu obserwacyjnym, wszystkie składniki należy szybko i dokładnie wymieszać, aby rozpocząć reakcję. Rejestracja danych powinna rozpocząć się natychmiast po wymieszaniu, a wykrywalny sygnał z testu powinien zostać wykreślony dla pełnego przebiegu czasowego reakcji.

Szukasz bardziej szczegółowych informacji?

Odwiedź naszą wyszukiwarkę dokumentów, aby znaleźć arkusze danych, certyfikaty i dokumentację techniczną.

Znajdź dokumenty