Bioprzetwarzanie i skalowanie zawiesiny komórek HEK293 do produkcji AAV

Platforma produkcyjna VirusExpress^® 293 AAV adresuje częstym wyzwaniom związanym z tradycyjną hodowlą komórek adherentnych poprzez zapewnienie skalowalnego procesu hodowli komórek w zawiesinie przy użyciu chemicznie zdefiniowanych pożywek do hodowli komórek niezawierających składników pochodzenia zwierzęcego. Ustalony proces produkcyjny pomaga zmniejszyć ryzyko produkcyjne i przyspieszyć wprowadzenie leku do kliniki.

Ten artykuł techniczny omawia, w jaki sposób:

• Rozwinęliśmy linię komórek HEK293
• Zoptymalizowaliśmy proces upstream
Optymalizacja procesu upstream
• Weryfikacja elastyczności platformy w zakresie serotypów AAV

Wybór klonu HEK293 i adaptacja zawiesiny do produkcji AAV

Człowiecze embrionalne komórki nerki (HEK293) są linią komórkową wybieraną do badań nad produkcją AAV metodą produkcji przejściowej, a nie liniami komórkowymi zawierającymi antygen SV40 large T (np. HEK293T). Wynika to z ryzyka, że podczas gdy AAV zawiera jednoniciowe DNA, może również zawierać DNA komórki gospodarza, które może przenosić geny transformujące, takie jak duży antygen T.

Zaczynając od adherentnej linii komórkowej HEK293, wybraliśmy klony o wysokim wzroście i wysokiej zdolności do transfekcji. Następnie kilka klonów zostało przystosowanych do hodowli komórek w zawiesinie w chemicznie zdefiniowanej pożywce EX-CELL^® CD HEK293 Viral Vector Media. Wybrany klon został wybrany na podstawie jego zdolności do wytwarzania wysokiego miana; klon został wyprodukowany i w pełni scharakteryzowany zgodnie ze standardami GMP w celu wygenerowania głównego i roboczego banku komórek w zakładzie BioReliance^® w Rockville, MD.

AV Production Upstream Process Development

Rozwój procesu bioreaktora upstream wykorzystywał dwuetapowy projekt podobny do podejścia zastosowanego do opracowania .VirusExpress^® Lentiviral Production Platform, w którym naukowcy najpierw skupili się na optymalizacji parametrów wzrostu komórek (etap 1), a następnie zoptymalizowali parametry produkcji wirusów (etap 2).

Etap 1: Parametry wzrostu komórek

Wstępne prace nad bioreaktorem przeprowadzono w skali laboratoryjnej w bioreaktorach o pojemności 3 l, gdzie przeprowadzono kilka badań wzrostu, testując różne parametry bioreaktora, takie jak szybkość mieszania i nastawy pH (Rysunek 1).

Rysunek 1. A) Wpływ szybkości mieszania na wzrost komórek VirusExpress^® 293 AAV w bioreaktorach Mobius^® 3 L. Linie ciągłe oznaczają gęstość komórek zdolnych do życia, a linie przerywane oznaczają ich żywotność. Legenda: SF = kolba z przegrodą 500 mL; BR = bioreaktor.

Rysunek 1. B) Optymalizacja pH dla wzrostu komórek VirusExpress^® 293 AAV w bioreaktorach Mobius^® 3 L. Linie ciągłe oznaczają gęstość żywotnych komórek, a linie przerywane oznaczają ich żywotność. Legenda: SF = kolba z przegrodą 500 mL; BR = bioreaktor.

Po zidentyfikowaniu optymalnych parametrów wzrostu komórek, zespół przetestował wpływ zwiększania skali na gęstość żywotnych komórek w bioreaktorze Mobius^® o pojemności 50 l. Mieszanie komórek zostało zwiększone w oparciu o moc na jednostkę objętości, podczas gdy inne parametry, takie jak temperatura i pH, pozostały na ustawieniach stosowanych w skali 3 litrów (Rysunek 2). Wzrost osiągnięty na etapie N przekroczył docelową gęstość żywotnych komórek (VCD) wynoszącą 2x10⁶ komórek/ml do transfekcji.

Rysunek 2. Wzrost komórek VirusExpress^® 293 AAV w bioreaktorze Mobius^® 50 L przy objętości roboczej 10 L i 40 L. Bioreaktor jest wykorzystywany do ekspansji komórek (etap N-1) przed etapem produkcji wirusa (etap N). Ekspansja komórek rozpoczyna się od objętości 10 l i jest rozcieńczana w stosunku 1:4 po trzech dniach wzrostu komórek. Linie ciągłe oznaczają gęstość komórek zdolnych do życia, a linie przerywane oznaczają ich żywotność. Legenda: SF = kolba z przegrodą o pojemności 500 ml; BR = bioreaktor.

Etap 2: Parametry produkcji wirusów

Po zakończeniu etapu 1, zoptymalizowaliśmy parametry produkcji wirusów (etap 2).

Używając oprogramowania do analizy statystycznej i podejścia DOE (Design of Experiments), ustalono podstawowe parametry produkcji dla potrójnej transfekcji plazmidów odczynnikiem do transfekcji PEI. Przebieg procesu jest następujący:

• Wzrost (24 godziny)
  • Dzień 0: Inokulacja
  • Dzień 1: Potrójna transfekcja plazmidu za pomocą PEI
• AV2 Production (72 hours)
  • Day 2-3: Monitorowanie i pobieranie próbek
  • Dzień 4: Zbiór i liza komórek

Proces produkcji przekroczył nasz cel 1x10⁹ gc/mL za pomocą cyfrowej reakcji PCR w kropli (ddPCR) zarówno dla AAV2 (9x10⁹ gc/mL), jak i AAV5 (9x10¹⁰ gc/mL) (Rysunek 3). Odporność warunków produkcyjnych została udowodniona nie tylko w skali kolby wstrząsanej, ale także w skali 3 L. Ze względu na ściślejszą kontrolę środowiska produkcyjnego w bioreaktorach o pojemności 3 l, obserwuje się wyższą wydajność produkcji w bioreaktorach o pojemności 3 l w porównaniu do kontroli kolb wytrząsanych.

Rysunek 3. Miana genomu AAV (ddPCR) dla AAV2 i AAV5 wyprodukowanych w bioreaktorach Mobius^® o pojemności 3 l (słupki pełne) i kolbach wstrząsanych o pojemności 250 ml (słupki kreskowane). Każdy słupek reprezentuje średnią z replik kolb wstrząsanych lub bioreaktorów; słupki błędów to odchylenia standardowe.

Dzięki planowanym usprawnieniom procesu w zakresie nie tylko optymalizacji odczynników do transfekcji, ale także warunków pożywek do hodowli komórkowych, zaobserwowaliśmy co najmniej 6-krotny wzrost miana genomu AAV2 w porównaniu ze średnim procesem wyjściowym 3 L z 9x10⁹ do 5x10¹⁰ gc/mL, jak pokazano na Rysunku 4.

Rysunek 4. Planowane ulepszenia wydajności pozwolą osiągnąć co najmniej 6-krotny wzrost miana genomu z 9x10⁹ gc/mL do 5x10¹⁰ gc/mL dla produkcji AAV2.

Elastyczność platformy Upstream w zakresie różnych serotypów AAV

Zidentyfikowano ponad 10 naturalnych serotypów AAV i opracowuje się serotypy hybrydowe dla AAV. Wybór serotypu ma kluczowe znaczenie dla zastosowania celu terapeutycznego. Platforma produkcyjna VirusExpress^® 293 AAV została wykorzystana do produkcji różnych serotypów AAV, wykazując, że platforma może być modyfikowana w wielu serotypach (Rysunek 5).

Rysunek 5. Miana genomu AAV (ddPCR) dla serotypów 2, 5 i 6 produkowanych w kolbach wstrząsanych. Każdy słupek reprezentuje średnią z replikowanych kolb wytrząsanych, a słupki błędów to odchylenia standardowe.

W przypadku procesów produkcji transfekcji przejściowej zarówno lentiwirusów, jak i AAV, kompleks transfekcyjny powstaje w wyniku interakcji ładunek-ładunek między plazmidowym DNA a odczynnikiem transfekcyjnym, zazwyczaj PEI. Tworzone kompleksy transfekcji (PEI-DNA) mogą z czasem zmieniać swój rozmiar. Scharakteryzowaliśmy proces tworzenia kompleksu i zidentyfikowaliśmy wąskie okno czasowe wymagane do wygenerowania optymalnego rozmiaru kompleksu, który pokrywa się z maksymalną produktywnością wirusa. Na podstawie tych badań stwierdziliśmy, że czas jest krytycznym parametrem dla przejściowego procesu transfekcji opartego na PEI i może stanowić ograniczenie procesu podczas pracy z bioreaktorami o dużej objętości. W związku z tym badamy możliwości współpracy z producentami odczynników do transfekcji, aby ustalić, czy istnieją alternatywy dla odczynnika do transfekcji opartego na PEI, a konkretnie takiego, który zapewni lepszą skalowalność. Wczesne oceny kationowych polimerów i lipidowych/polimerowych odczynników do transfekcji wykazały zwiększoną produkcję AAV2 w skali kolby wstrząsanej, patrz Rysunek 6.

Rysunek 6. Miana genomu AAV2 (ddPCR) wytworzone przy użyciu różnych odczynników do transfekcji w kolbach wstrząsanych. Każdy słupek reprezentuje średnią z replikowanych kolb wytrząsanych; słupki błędów to odchylenia standardowe.