Przewodnik po dysocjacji tkanek: Typy enzymów kolagenazy, dyspazy i liberazy
Ogólne informacje o naszych enzymach do dysocjacji tkanek
- Opis naszych enzymów kolagenazy
- Produkty zawierające enzymy kolagenazy
- Kolagenaza i Liberaza®./a>
- Collagenase and Liberase® Enzymy firmy Roche
- Collagenase Assays
- Collagenase Tissue Digestion/Dissocation Troubleshooting and References
Kolagenazy to enzymy, które rozkładają natywny kolagen utrzymujący tkanki zwierzęce razem i są wytwarzane przez różne mikroorganizmy i wiele różnych komórek zwierzęcych1. Najsilniejszą kolagenazą jest "surowa" kolagenaza wydzielana przez bakterie beztlenowe Clostridium histolyticum. Pierwotnie przyjęliśmy proces fermentacji i oczyszczania z 1953 r. opisany przez MacLennana, Mandla i Howesa2, ale ostatecznie udoskonaliliśmy go w celu uzyskania produktów o wyższej aktywności. "Surowa" kolagenaza odnosi się do faktu, że materiał jest mieszaniną kilku różnych enzymów oprócz kolagenazy, które działają razem w celu rozbicia tkanki. Obecnie wiadomo, że obecne są dwie formy enzymu kolagenazy3,4. Z kilkoma wyjątkami różne komercyjne kolagenazy są wytwarzane z C. histolyticum lub są rekombinowanymi wersjami, w których Escherichia coli wyraża gen sklonowany z C. histolyticum.
Opis naszych enzymów kolagenazy
Różne produkty kolagenazy w poniższych tabelach zostały opracowane, ponieważ każdy z nich trawi niektóre rodzaje tkanek (mięśnie, trzustkę, serce, tkankę tłuszczową) lepiej niż inne. Oprócz spełnienia specyfikacji aktywności enzymu, każda partia naszych produktów kolagenazy musi przejść testy trawienia z różnymi tkankami szczurów. Produkty, które są również opisane jako "testowane na hodowlach komórkowych" przeszły dodatkowe testy na liniach komórkowych ssaków w celu sprawdzenia, czy nie są cytotoksyczne.
Filtrowane sterylnie (0.2 mm) przygotowane z niektórych bardziej popularnych produktów kolagenazy są również wymienione poniżej.
Nasze oczyszczone produkty kolagenazy mają tylko śladowe ilości kazeinazy (proteolitycznej) lub aktywności klostrypazy. Oczyszczona kolagenaza typu VII jest również oferowana w wersjach testowanych w hodowli komórkowej i sterylnie filtrowanych.
| Produkt | Komentarze | FALGPAa | CDUb |
|---|---|---|---|
| C0130 | Do użytku ogólnego | 0.25 - 1.0 | > 125 |
| C1639, Typ I-S | Filtrowana sterylnie wersja C0130 | 0.25 - 1.0 | > 125 |
| C9891, Typ IA | Druga wersja Typu I do ogólnego użytku | 0.5 - 2.0 | > 125 |
| C2674, Typ IA | Testowana na kulturach komórkowych wersja C9891 | 0.5 - 2.0 | > 125 |
| C5894, Typ IA-S | Filtrowana sterylnie wersja C9891 | 0.5 - 2.0 | > 125 |
| C9722, typ IA-S | Testowana w hodowli komórkowej i sterylnie filtrowana wersja C9891 | 0.5 - 2.0 | > 125 |
Surowa kolagenaza, testowana pod kątem użycia
| Produkt | Komentarze | FALGPA a | CDU b |
|---|---|---|---|
| C6885, typ II | Testowany jako odpowiedni do trawienia i uwalniania komórek tłuszczowych (adipose) z nieuszkodzonymi receptorami na powierzchni komórek dla insuliny5,6 | 0.5 - 2.0 | > 125 |
| C1764, Typ II-S | Filtrowana sterylnie wersja C6885 | 0.5 - 2.0 | > 125 |
| C5138., typ IV | Testowany jako odpowiedni do trawienia i uwalniania żywych komórek wątroby szczura (hepatocytów)7 | 0.5 - 2.0 | > 125 |
| C1889, Typ IV-S | Filtrowana sterylnie wersja C5138 | 0.5 - 2.0 | > 125 |
| C2139, Typ VIII | Przeszedł zarówno test tkanki tłuszczowej (patrz C6885)5, 6 i test tkanki wątrobowej (patrz C5138)7 | 0.5 - 2.0 | > 125 |
| C9263, Typ V | Testowany jako odpowiedni do trawienia i uwalniania wysepek Langerhansa (komórek produkujących insulinę) z trzustki szczura8,9 | 1.0 - 3.0 | > 125 |
| C2014, Typ V-S | Filtrowana sterylnie wersja C9263 | 1.0 - 3.0 | > 125 |
| C7657, Typ XI | Ma najwyższą aktywność kolagenazy - przetestowany jako odpowiedni do trawienia i uwalniania wysepek Langerhansa (komórek produkujących insulinę) z trzustki szczura8,9 | 2.0 - 5.0 | > 1,200 |
| C9407, Typ XI | Testowana na kulturach komórkowych wersja C7657 | 2.0 - 5.0 | > 1,200 |
| C4785, Typ XI-S | Filtrowana sterylnie wersja C7657 | 2.0 - 5.0 | > 1,200 |
| C9697, Typ XI-S | Testowana na hodowlach komórkowych i sterylnie filtrowana wersja C7657 | 2.0 - 5.0 | > 1,200 |
Chromatograficznie oczyszczona kolagenaza
| Produkt | Komentarze | FALGPAa | CDUb |
|---|---|---|---|
| C0255, typ III | Purified collagenase that has trace amounts of protease activity | 4 - 12 | ≥ 250 |
| C0773, Typ VII | Purified collagenase substantially free of protease and Clostripain | 4 - 12 | 1,000 - 3,000 |
| C2799, typ VII | Testowana w hodowli komórkowej wersja C0773 | 4 - 12 | 1,000 - 3,000 |
| C2399, Typ VII-S | Filtrowana sterylnie wersja C0773 | 4 - 12 | 1,000 - 3,000 |
| C9572, Typ VII-S | Testowana na hodowlach komórkowych i sterylnie filtrowana wersja C0773 | 4 - 12 | 1,000 - 3,000 |
Surowa kolagenaza z inhibitorem aktywności proteolitycznej
| Produkt | Komentarze | FALGPA a | CDU b |
|---|---|---|---|
| C6079, Typ S | Blend kolagenazy typu XI z inhibitorem proteazy tryptycznej. Testowany jako odpowiedni do trawienia i uwalniania wysepek Langerhansa (komórek produkujących insulinę) z trzustki szczura8, 9 | 2 - 5 | Minimum 1,000 |
Collagenase Blends™
Produkty te zostały opracowane w celu zapewnienia większej powtarzalności trawienia kolagenazy w poszczególnych partiach. Proporcja oczyszczonej kolagenazy (mieszanka F) do oczyszczonej obojętnej proteazy klostridialnej jest zróżnicowana w mieszankach H i L, aby zapewnić badaczom szereg opcji trawienia.
| Produkt | Komentarze | FALGPAa | Proteasec |
|---|---|---|---|
| C7926, Blend F | Przeważnie prawdziwe kolagenazy. Ponieważ aktywność FALGPA jest wysoka w porównaniu do CDU, zakłada się, że forma kolagenazy typu II jest w większości obecna | Min. 2.0 | < 10 |
| C8051, Blend H | Niewielka aktywność proteazy neutralnej połączona z aktywnością kolagenazy | Min. 1,0 | Min. 10 |
| C8176, Blend L< | Większa aktywność neutralnej proteazy jest zawarta w prawdziwej kolagenazie | < 1.0 | Min. 40 |
Collagenase and Liberase® Enzymes from Roche
Enzymy kolagenazy firmy Roche są intuicyjnie zaprojektowane i zaufane, aby zapewnić stałą wydajność i powtarzalne wyniki w rutynowych i krytycznych zastosowaniach. Kolagenaza nadaje się do przygotowywania komórek z wielu rodzajów tkanek, takich jak hepatocyty, adipocyty, wysepki trzustkowe, komórki nabłonkowe, komórki mięśniowe i komórki śródbłonka. Jednak przydatność każdej partii enzymu do przerwania tkanki powinna być określona empirycznie. Dodatkowo, nasza technologia enzymatyczna Liberase® łączy wysoce oczyszczone enzymy kolagenazy I i II z Dispase® lub Thermolysin, aby ułatwić dysocjację szerokiego zakresu typów tkanek.
Przewodnik po aplikacji Liberase Research Grade
| Tissue Type | TL | TM | TH | DL | DH | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Wątroba | + | + | ||||
| Nerka | + | ++ | ||||
| Skóra | + | ++ | ||||
| Serce | + | + | + | |||
| Trzustka (wysepki) | ++ | + | ||||
| Węzeł chłonny* | ++ | + | ||||
| Śledziona* | ++ | |||||
| Płuca* | ++ | ++ | ||||
| Tkanka jajnika*< | ++ | |||||
| Tkanka tłuszczowa* | ++ | |||||
| Cornea* | ++ |
Enzymy dyspazy
Wraz z enzymami dostępnymi w Roche, jesteśmy zaangażowani w dostarczanie odczynników do dysocjacji tkanek, które są wysoce oczyszczone i niezawodne dla konkretnych potrzeb aplikacyjnych. Delikatny enzym, który nie uszkadza błon komórkowych, dyspaza jest odpowiednia do oddzielania różnych tkanek i komórek hodowanych in vitro oraz do zapobiegania zlepianiu się komórek w hodowlach zawiesinowych.
Collagenase Assays
Formy typu I i typu II oczyszczonych enzymów kolagenazy różnią się specyficznością i względną aktywnością na natywnym kolagenie i syntetycznych substratach. Te dwie kolagenazy można rozróżnić głównie na podstawie ich preferencji dla jednego z dwóch różnych substratów stosowanych w naszych testach. Test Collagenase Digestive Unit (CDU)10,11 mierzy głównie aktywność kolagenazy I, która rozszczepia dwa z trzech łańcuchów helikalnych w długim, niezdenaturowanym białku kolagenu. Aktywność kolagenazy II jest mierzona zdolnością tego enzymu do cięcia krótkiego syntetycznego peptydu, N-[3-(2-furylo)akryloilo)]-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA, patrz nr produktu. F5135), w drugim teście trawienia kolagenazy12,13. Wykazano, że oczyszczone preparaty kolagenazy I lub II są mniej skuteczne w trawieniu różnych rodzajów kolagenu lub tkanek ssaków w porównaniu z mieszaniną obu form tego enzymu. Oczyszczona kolagenaza zawierająca tylko formy kolagenazy I i II tego enzymu jest mniej skuteczna w trawieniu tkanki niż cała surowa kolagenaza lub kombinacje oczyszczonej kolagenazy i różnych proteaz. Oczywiście połączenie prawdziwej kolagenazy i różnych natywnych proteaz, klostrypazy i aminopeptydaz, które wyewoluowały w przyrodzie, pomagają sobie nawzajem w trawieniu kolagenu w różnych tkankach zwierzęcych. Do trawienia tkanek surowe produkty kolagenazy zawsze były najbardziej skuteczne. Niektórzy badacze wypróbowali mieszaniny chromatograficznie oczyszczonej kolagenazy z proteazą, taką jak trypsyna lub subtylizyna, w celu trawienia tkanek.
Oprócz testów CDU i FALGPA na aktywność kolagenazy, testujemy każdą partię produktu pod kątem aktywności kazeinazy14,15, klostrypainy i tryptazy, aby sprawdzić aktywność enzymów proteolitycznych w produktach kolagenazy. Test kazeinazowy jest najważniejszym z trzech testów do pomiaru aktywności proteolitycznej, która wspomaga trawienie tkanek zwierzęcych. Ponieważ klostripaina obecna w surowej kolagenazie musi zostać zredukowana (np. poprzez traktowanie ditiotreitolem), aby była aktywna, enzym ten prawdopodobnie w niewielkim stopniu przyczynia się do procesu dysocjacji tkanek w laboratorium. Jest on monitorowany, ponieważ niektórzy badacze donoszą, że Clostripain może być szkodliwy lub toksyczny.
Wiele produktów kolagenazy, które spełniają specyfikacje enzymatyczne, jest również testowanych z różnymi tkankami uzyskanymi od szczurów. Typ II (C6885, C1764) i typ VIII (C2139) są testowane pod kątem zdolności do uwalniania komórek tłuszczowych z najądrzy szczurów5. Komórki tłuszczowe są następnie badane pod kątem aktywności metabolicznej poprzez pomiar szybkości utleniania glukozy z dodatkiem i bez dodatku insuliny. Typ IV (C5138, C1889) i typ VIII (C2139) zostały przetestowane pod kątem zdolności do uwalniania żywych komórek z wątroby szczura7. Typ V (C9263, C2014), typ XI (C7657, C4785, C9407 i C9697) i typu S (C6079) muszą uwalniać nienaruszone wysepki Langerhansa z trzustki szczura, aby przejść test produktu8.
Rozwiązywanie problemów i referencje związane z trawieniem/dysocjacją tkanek za pomocą kolagenazy
Na podstawie naszych własnych badań i rozwoju oraz rozmów z klientami jasne jest, że sposób, w jaki dana tkanka jest wycinana i przygotowywana, ma znaczący wpływ na szybkość i skuteczność trawienia/dysocjacji tkanek za pomocą kolagenazy. Różnice w wieku dawców tkanek mogą być również głównym źródłem zmienności w czasie. Należy upewnić się, że jony wapnia są obecne w buforach trawiących w stężeniu 5 mM. Środki chelatujące EGTA i EDTA mogą poważnie hamować aktywność kolagenazy poprzez usuwanie jonów wapnia niezbędnych do stabilności i aktywności enzymu. β-merkaptoetanol16, cysteina16 i 8-hydroksychinolino-5-sulfonian16 to inne substancje hamujące. Nowa partia kolagenazy o wyższej aktywności specyficznej może powodować nadmierną śmierć komórek w ustalonym stężeniu. W takim przypadku należy użyć mniej kolagenazy i/lub dodać BSA lub surowicę (odpowiednio do 0,5% i 5-10%), aby ustabilizować komórki do dalszego trawienia.
| Problem | Przyczyna | Rozwiązanie | Odniesienie |
|---|---|---|---|
| Strawianie jest słabe | Nieaktywne enzymy Niewystarczająca ilość Ca++ Niewystarczająca ilość enzymów | Przechowywać kolagenazę w suchym i chłodnym miejscu. Przechowywać roztwór kolagenazy w zamrożonych porcjach. Dodać 5 mM Ca++ do roztworu kolagenazy. Użyć więcej kolagenazy. Wypróbuj nasze mieszanki o większej aktywności proteazy. | 6 7 |
| DNA uwolnione z uszkodzonych komórek Nieodpowiednie gumy niebiałkowe | Zmniejszyć mieszanie Dodać DNAzę** Dobrze przepłukać tkankę przed trawieniem*** Nie używać Mg++ w roztworze trawiącym Dodać hialuronidazę z enzymami** | 7 9 7 7 7 18 | |
| Komórki są zabijane | Nadmiar proteaz Zmiany pH Zbyt mało tlenu | Zmniejszenie ekspozycji na proteazy* Dodanie albuminy lub podgrzanej surowicy Użycie buforów (np.HEPES) zamiast HCO-3. Często sprawdzać i dostosowywać pH Napowietrzać roztwór trawiący (powietrzem lub O2) Trawić szybciej, stosując więcej enzymów | 7 19 |
| Wydajność komórek jest niska | Równowaga enzymatyczna Czynniki adhezyjne | Użyj więcej kolagenazy* Dołącz elastazę do kolagenazy** Perfuzuj najpierw tkankę, aby usunąć Ca++*** | 20 7 |
| Wiele komórek jest uszkodzonych | Nadmiar proteazy< Uszkodzenia fizyczne | Używaj mniej proteazy* Dodaj albuminę lub podgrzaną surowicę Obchodź się z tkankami i komórkami bardzo delikatnie | 21 7 |
| Nowa partia nie działa | Odmiana partii | Używaj frakcjonowanych "mieszanek" kolagenazy (Nr produktu. C7926, C8051 lub C8176)* |
* Oddzielnie przygotowane enzymy kolagenazy i proteazy w produktach "Blend" (nr. C7926, C8051 lub C8176) zapewniają powtarzalną kontrolę ilości każdego z nich.
** DNAza zostanie dezaktywowana przez nadmierne mieszanie, a dodane enzymy mogą zostać strawione przez neutralną proteazę obecną w kolagenazie.
*** Użyj EGTA (lub EDTA), aby usunąć Ca++ i wypłukać mikroorganizmy, a następnie przemyj tkankę buforem, aby usunąć środek chelatujący. Nie dodawać EGTA ani EDTA do roztworów enzymów!
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?