Przejdź do zawartości
Merck
Strona głównaSygnalizacja komórkowaPrzewodnik po dysocjacji tkanek: Typy enzymów kolagenazy, dyspazy i liberazy

Przewodnik po dysocjacji tkanek: Typy enzymów kolagenazy, dyspazy i liberazy

Ogólne informacje o naszych enzymach do dysocjacji tkanek

Kolagenazy to enzymy, które rozkładają natywny kolagen utrzymujący tkanki zwierzęce razem i są wytwarzane przez różne mikroorganizmy i wiele różnych komórek zwierzęcych1. Najsilniejszą kolagenazą jest "surowa" kolagenaza wydzielana przez bakterie beztlenowe Clostridium histolyticum. Pierwotnie przyjęliśmy proces fermentacji i oczyszczania z 1953 r. opisany przez MacLennana, Mandla i Howesa2, ale ostatecznie udoskonaliliśmy go w celu uzyskania produktów o wyższej aktywności. "Surowa" kolagenaza odnosi się do faktu, że materiał jest mieszaniną kilku różnych enzymów oprócz kolagenazy, które działają razem w celu rozbicia tkanki. Obecnie wiadomo, że obecne są dwie formy enzymu kolagenazy3,4. Z kilkoma wyjątkami różne komercyjne kolagenazy są wytwarzane z C. histolyticum lub są rekombinowanymi wersjami, w których Escherichia coli wyraża gen sklonowany z C. histolyticum.

Opis naszych enzymów kolagenazy

Różne produkty kolagenazy w poniższych tabelach zostały opracowane, ponieważ każdy z nich trawi niektóre rodzaje tkanek (mięśnie, trzustkę, serce, tkankę tłuszczową) lepiej niż inne. Oprócz spełnienia specyfikacji aktywności enzymu, każda partia naszych produktów kolagenazy musi przejść testy trawienia z różnymi tkankami szczurów. Produkty, które są również opisane jako "testowane na hodowlach komórkowych" przeszły dodatkowe testy na liniach komórkowych ssaków w celu sprawdzenia, czy nie są cytotoksyczne.

Filtrowane sterylnie (0.2 mm) przygotowane z niektórych bardziej popularnych produktów kolagenazy są również wymienione poniżej.

Nasze oczyszczone produkty kolagenazy mają tylko śladowe ilości kazeinazy (proteolitycznej) lub aktywności klostrypazy. Oczyszczona kolagenaza typu VII jest również oferowana w wersjach testowanych w hodowli komórkowej i sterylnie filtrowanych.

Produkty enzymatyczne kolagenazy - kolagenaza surowa, oczyszczona chromatograficznie, kolagenaza z inhibitorem aktywności proteolitycznej i mieszanki

Kolagenaza surowa do użytku ogólnego

ProduktKomentarzeFALGPAaCDUb
C0130Do użytku ogólnego0.25 - 1.0> 125
C1639, Typ I-SFiltrowana sterylnie wersja C01300.25 - 1.0> 125
C9891, Typ IADruga wersja Typu I do ogólnego użytku0.5 - 2.0> 125
C2674, Typ IATestowana na kulturach komórkowych wersja C98910.5 - 2.0> 125
C5894, Typ IA-SFiltrowana sterylnie wersja C98910.5 - 2.0> 125
C9722, typ IA-STestowana w hodowli komórkowej i sterylnie filtrowana wersja C98910.5 - 2.0> 125
a, b FALGPA i jednostki trawienne kolagenazy (CDU) podane w jednostkach na mg/stałe

Surowa kolagenaza, testowana pod kątem użycia

ProduktKomentarzeFALGPA aCDU b
C6885, typ IITestowany jako odpowiedni do trawienia i uwalniania komórek tłuszczowych (adipose) z nieuszkodzonymi receptorami na powierzchni komórek dla insuliny5,60.5 - 2.0> 125
C1764, Typ II-SFiltrowana sterylnie wersja C68850.5 - 2.0> 125
C5138., typ IVTestowany jako odpowiedni do trawienia i uwalniania żywych komórek wątroby szczura (hepatocytów)70.5 - 2.0> 125
C1889, Typ IV-SFiltrowana sterylnie wersja C51380.5 - 2.0> 125
C2139, Typ VIIIPrzeszedł zarówno test tkanki tłuszczowej (patrz C6885)5, 6 i
test tkanki wątrobowej (patrz C5138)7
0.5 - 2.0> 125
C9263, Typ VTestowany jako odpowiedni do trawienia i uwalniania wysepek
Langerhansa (komórek produkujących insulinę) z trzustki szczura8,9
1.0 - 3.0> 125
C2014, Typ V-SFiltrowana sterylnie wersja C92631.0 - 3.0> 125
C7657, Typ XIMa najwyższą aktywność kolagenazy - przetestowany jako odpowiedni do
trawienia i uwalniania wysepek Langerhansa (komórek produkujących insulinę) z trzustki szczura8,9
2.0 - 5.0> 1,200
C9407, Typ XITestowana na kulturach komórkowych wersja C76572.0 - 5.0> 1,200
C4785, Typ XI-SFiltrowana sterylnie wersja C76572.0 - 5.0> 1,200
C9697, Typ XI-STestowana na hodowlach komórkowych i sterylnie filtrowana wersja C76572.0 - 5.0> 1,200
a, b FALGPA i jednostki trawienne kolagenazy (CDU) podane w jednostkach na mg/stałe

Chromatograficznie oczyszczona kolagenaza

ProduktKomentarzeFALGPAaCDUb
C0255, typ IIIPurified collagenase that has trace amounts of protease activity4 - 12≥ 250 
C0773, Typ VIIPurified collagenase substantially free of protease and Clostripain4 - 121,000 - 3,000
C2799, typ VIITestowana w hodowli komórkowej wersja C07734 - 121,000 - 3,000
C2399, Typ VII-SFiltrowana sterylnie wersja C07734 - 121,000 - 3,000
C9572, Typ VII-STestowana na hodowlach komórkowych i sterylnie filtrowana wersja C07734 - 121,000 - 3,000
a, b FALGPA i jednostki trawienne kolagenazy (CDU) podane w jednostkach na mg/stałe

Surowa kolagenaza z inhibitorem aktywności proteolitycznej

ProduktKomentarzeFALGPA aCDU b
C6079, Typ SBlend kolagenazy typu XI z inhibitorem proteazy tryptycznej.
Testowany jako odpowiedni do trawienia i uwalniania wysepek
Langerhansa (komórek produkujących insulinę) z trzustki szczura8, 9
2 - 5Minimum 1,000
a, b FALGPA i jednostki trawienne kolagenazy (CDU) podane w jednostkach na mg/stałe

Collagenase Blends™

Produkty te zostały opracowane w celu zapewnienia większej powtarzalności trawienia kolagenazy w poszczególnych partiach. Proporcja oczyszczonej kolagenazy (mieszanka F) do oczyszczonej obojętnej proteazy klostridialnej jest zróżnicowana w mieszankach H i L, aby zapewnić badaczom szereg opcji trawienia.

ProduktKomentarzeFALGPAaProteasec
C7926, Blend FPrzeważnie prawdziwe kolagenazy. Ponieważ aktywność FALGPA jest wysoka w porównaniu do
CDU, zakłada się, że forma kolagenazy typu II jest w większości obecna
Min. 2.0< 10
C8051, Blend HNiewielka aktywność proteazy neutralnej połączona z aktywnością kolagenazyMin. 1,0Min. 10
C8176, Blend L<Większa aktywność neutralnej proteazy jest zawarta w prawdziwej kolagenazie< 1.0Min. 40
a, c FALGPA i jednostki trawienne kolagenazy (CDU) podane w jednostkach na mg/stałe

Collagenase and Liberase® Enzymes from Roche

Enzymy kolagenazy firmy Roche są intuicyjnie zaprojektowane i zaufane, aby zapewnić stałą wydajność i powtarzalne wyniki w rutynowych i krytycznych zastosowaniach. Kolagenaza nadaje się do przygotowywania komórek z wielu rodzajów tkanek, takich jak hepatocyty, adipocyty, wysepki trzustkowe, komórki nabłonkowe, komórki mięśniowe i komórki śródbłonka. Jednak przydatność każdej partii enzymu do przerwania tkanki powinna być określona empirycznie. Dodatkowo, nasza technologia enzymatyczna Liberase® łączy wysoce oczyszczone enzymy kolagenazy I i II z Dispase® lub Thermolysin, aby ułatwić dysocjację szerokiego zakresu typów tkanek.

Przewodnik po aplikacji Liberase Research Grade

Tissue TypeTLTMTHDLDH
Wątroba + +
Nerka + ++
Skóra +++
Serce ++ +
Trzustka (wysepki)++ +
Węzeł chłonny*+++
Śledziona*++
Płuca*++++
Tkanka jajnika*< ++
Tkanka tłuszczowa* ++
Cornea* ++
*Dane na podstawie publikacji
Materiały
Loading

Enzymy dyspazy

Wraz z enzymami dostępnymi w Roche, jesteśmy zaangażowani w dostarczanie odczynników do dysocjacji tkanek, które są wysoce oczyszczone i niezawodne dla konkretnych potrzeb aplikacyjnych. Delikatny enzym, który nie uszkadza błon komórkowych, dyspaza jest odpowiednia do oddzielania różnych tkanek i komórek hodowanych in vitro oraz do zapobiegania zlepianiu się komórek w hodowlach zawiesinowych.

Loading

Collagenase Assays

Formy typu I i typu II oczyszczonych enzymów kolagenazy różnią się specyficznością i względną aktywnością na natywnym kolagenie i syntetycznych substratach. Te dwie kolagenazy można rozróżnić głównie na podstawie ich preferencji dla jednego z dwóch różnych substratów stosowanych w naszych testach. Test Collagenase Digestive Unit (CDU)10,11 mierzy głównie aktywność kolagenazy I, która rozszczepia dwa z trzech łańcuchów helikalnych w długim, niezdenaturowanym białku kolagenu. Aktywność kolagenazy II jest mierzona zdolnością tego enzymu do cięcia krótkiego syntetycznego peptydu, N-[3-(2-furylo)akryloilo)]-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA, patrz nr produktu. F5135), w drugim teście trawienia kolagenazy12,13. Wykazano, że oczyszczone preparaty kolagenazy I lub II są mniej skuteczne w trawieniu różnych rodzajów kolagenu lub tkanek ssaków w porównaniu z mieszaniną obu form tego enzymu. Oczyszczona kolagenaza zawierająca tylko formy kolagenazy I i II tego enzymu jest mniej skuteczna w trawieniu tkanki niż cała surowa kolagenaza lub kombinacje oczyszczonej kolagenazy i różnych proteaz. Oczywiście połączenie prawdziwej kolagenazy i różnych natywnych proteaz, klostrypazy i aminopeptydaz, które wyewoluowały w przyrodzie, pomagają sobie nawzajem w trawieniu kolagenu w różnych tkankach zwierzęcych. Do trawienia tkanek surowe produkty kolagenazy zawsze były najbardziej skuteczne. Niektórzy badacze wypróbowali mieszaniny chromatograficznie oczyszczonej kolagenazy z proteazą, taką jak trypsyna lub subtylizyna, w celu trawienia tkanek.

Oprócz testów CDU i FALGPA na aktywność kolagenazy, testujemy każdą partię produktu pod kątem aktywności kazeinazy14,15, klostrypainy i tryptazy, aby sprawdzić aktywność enzymów proteolitycznych w produktach kolagenazy. Test kazeinazowy jest najważniejszym z trzech testów do pomiaru aktywności proteolitycznej, która wspomaga trawienie tkanek zwierzęcych. Ponieważ klostripaina obecna w surowej kolagenazie musi zostać zredukowana (np. poprzez traktowanie ditiotreitolem), aby była aktywna, enzym ten prawdopodobnie w niewielkim stopniu przyczynia się do procesu dysocjacji tkanek w laboratorium. Jest on monitorowany, ponieważ niektórzy badacze donoszą, że Clostripain może być szkodliwy lub toksyczny.

Wiele produktów kolagenazy, które spełniają specyfikacje enzymatyczne, jest również testowanych z różnymi tkankami uzyskanymi od szczurów. Typ II (C6885C1764) i typ VIII (C2139) są testowane pod kątem zdolności do uwalniania komórek tłuszczowych z najądrzy szczurów5. Komórki tłuszczowe są następnie badane pod kątem aktywności metabolicznej poprzez pomiar szybkości utleniania glukozy z dodatkiem i bez dodatku insuliny. Typ IV (C5138, C1889) i typ VIII (C2139) zostały przetestowane pod kątem zdolności do uwalniania żywych komórek z wątroby szczura7. Typ V (C9263, C2014), typ XI (C7657, C4785, C9407 i C9697) i typu S (C6079) muszą uwalniać nienaruszone wysepki Langerhansa z trzustki szczura, aby przejść test produktu8.

Rozwiązywanie problemów i referencje związane z trawieniem/dysocjacją tkanek za pomocą kolagenazy

Na podstawie naszych własnych badań i rozwoju oraz rozmów z klientami jasne jest, że sposób, w jaki dana tkanka jest wycinana i przygotowywana, ma znaczący wpływ na szybkość i skuteczność trawienia/dysocjacji tkanek za pomocą kolagenazy. Różnice w wieku dawców tkanek mogą być również głównym źródłem zmienności w czasie. Należy upewnić się, że jony wapnia są obecne w buforach trawiących w stężeniu 5 mM. Środki chelatujące EGTA i EDTA mogą poważnie hamować aktywność kolagenazy poprzez usuwanie jonów wapnia niezbędnych do stabilności i aktywności enzymu. β-merkaptoetanol16, cysteina16 i 8-hydroksychinolino-5-sulfonian16 to inne substancje hamujące. Nowa partia kolagenazy o wyższej aktywności specyficznej może powodować nadmierną śmierć komórek w ustalonym stężeniu. W takim przypadku należy użyć mniej kolagenazy i/lub dodać BSA lub surowicę (odpowiednio do 0,5% i 5-10%), aby ustabilizować komórki do dalszego trawienia.

ProblemPrzyczynaRozwiązanieOdniesienie
Strawianie jest słabeNieaktywne enzymy

Niewystarczająca ilość Ca++

Niewystarczająca ilość enzymów
Przechowywać kolagenazę w suchym i chłodnym miejscu.

Przechowywać roztwór kolagenazy w zamrożonych porcjach.
Dodać 5 mM Ca++ do roztworu kolagenazy.

Użyć więcej kolagenazy. Wypróbuj nasze mieszanki o większej aktywności proteazy.
6


7
DNA uwolnione z uszkodzonych komórek

Nieodpowiednie gumy niebiałkowe
Zmniejszyć mieszanie
Dodać DNAzę**

Dobrze przepłukać tkankę przed trawieniem***
Nie używać Mg++ w roztworze trawiącym
Dodać hialuronidazę z enzymami**
7
9

7
7
7
18
Komórki są zabijaneNadmiar proteaz

Zmiany pH

Zbyt mało tlenu
Zmniejszenie ekspozycji na proteazy*
Dodanie albuminy lub podgrzanej surowicy

Użycie buforów (np.HEPES) zamiast HCO-3.
Często sprawdzać i dostosowywać pH

Napowietrzać roztwór trawiący (powietrzem lub O2)
Trawić szybciej, stosując więcej enzymów



7


19
Wydajność komórek jest niskaRównowaga enzymatyczna

Czynniki adhezyjne
Użyj więcej kolagenazy*
Dołącz elastazę do kolagenazy**

Perfuzuj najpierw tkankę, aby usunąć Ca++***

20

7
Wiele komórek jest uszkodzonychNadmiar proteazy<

Uszkodzenia fizyczne
Używaj mniej proteazy*
Dodaj albuminę lub podgrzaną surowicę

Obchodź się z tkankami i komórkami bardzo delikatnie
21


7
Nowa partia nie działaOdmiana partiiUżywaj frakcjonowanych "mieszanek" kolagenazy (Nr produktu. C7926C8051 lub C8176)* 

* Oddzielnie przygotowane enzymy kolagenazy i proteazy w produktach "Blend" (nr. C7926C8051 lub C8176) zapewniają powtarzalną kontrolę ilości każdego z nich.

** DNAza zostanie dezaktywowana przez nadmierne mieszanie, a dodane enzymy mogą zostać strawione przez neutralną proteazę obecną w kolagenazie.

*** Użyj EGTA (lub EDTA), aby usunąć Ca++ i wypłukać mikroorganizmy, a następnie przemyj tkankę buforem, aby usunąć środek chelatujący. Nie dodawać EGTA ani EDTA do roztworów enzymów!

Referencje

1.
Harper E. 1980. Collagenases. Annu. Rev. Biochem.. 49(1):1063-1078. https://doi.org/10.1146/annurev.bi.49.070180.005215
2.
MacLennan JD, Mandl I, Howes EL. 1953. BACTERIAL DIGESTION OF COLLAGEN 1. J. Clin. Invest.. 32(12):1317-1322. https://doi.org/10.1172/jci102860
3.
Bond MD, Van Wart HE. 1984. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23(13):3085-3091. https://doi.org/10.1021/bi00308a036
4.
Matsushita O, Jung C, Katayama S, Minami J, Takahashi Y, Okabe A. 1999. Gene Duplication and Multiplicity of Collagenases in Clostridium histolyticum. J. Bacteriol.. 181(3):923-933. https://doi.org/10.1128/jb.181.3.923-933.1999
5.
Rodbell M. 1964. Metabolism of Isolated Fat Cells. Journal of Biological Chemistry. 239(2):375-380. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)51687-2
6.
Fain JN. 1975. [53] Isolation of free brown and white fat cells.555-561. https://doi.org/10.1016/0076-6879(75)35184-7
7.
Seglen PO. 1976. Chapter 4 Preparation of Isolated Rat Liver Cells.29-83. https://doi.org/10.1016/s0091-679x(08)61797-5
8.
Lacy PE, Kostianovsky M. 1967. Method for the Isolation of Intact Islets of Langerhans from the Rat Pancreas. Diabetes. 16(1):35-39. https://doi.org/10.2337/diab.16.1.35
9.
Buitrago A, Gylfe E, Henriksson C, Pertoft H. 1977. Rapid isolation of pancreatic islets from collagenase digested pancreas by sedimentation through percoll? at unit gravity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 79(3):823-828. https://doi.org/10.1016/0006-291x(77)91185-8
10.
Moore S, Stein WH. 1948. PHOTOMETRIC NINHYDRIN METHOD FOR USE IN THE CHROMATOGRAPHY OF AMINO ACIDS. Journal of Biological Chemistry. 176(1):367-388. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)51034-6
11.
“Enzymatic Assay of Collagenase. Collagen Digestion Assay”, our quality control test procedure..
12.
Van Wart HE, Steinbrink D. 1981. A continuous spectrophotometric assay for Clostridium histolyticum collagenase. Analytical Biochemistry. 113(2):356-365. https://doi.org/10.1016/0003-2697(81)90089-0
13.
“Enzymatic Assay of Collagenase Using FALGPA as the Substrate”, our quality control test procedure..
14.
Anson M, Gen. Physiol. J. The Estimitation of Pepsin, Trypsin, Papain and Cathepsin with Hemoglobin. 22, 79 (1938).
15.
“Enzymatic Assay of Caseinase (Collagenase Products)”, our quality control test procedure..
16.
Seifter S, Gallop PM, Klein L, Meilman E. 1959. Studies on Collagen. Journal of Biological Chemistry. 234(2):285-293. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)70290-1
17.
Berry MN, Friend DS. 1969. HIGH-YIELD PREPARATION OF ISOLATED RAT LIVER PARENCHYMAL CELLS. 43(3):506-520. https://doi.org/10.1083/jcb.43.3.506
18.
Bellemann P, Gebhardt R, Mecke D. 1977. An improved method for the isolation of hepatocytes from liver slices. Analytical Biochemistry. 81(2):408-415. https://doi.org/10.1016/0003-2697(77)90711-4
19.
Ives HE, Schultz GS, Galardy RE, Jamieson JD. 1978. Preparation of functional smooth muscle cells from the rabbit aorta.. 148(5):1400-1413. https://doi.org/10.1084/jem.148.5.1400
20.
Fain JN, Loken SC. 1969. Response of Trypsin-treated Brown and White Fat Cells to Hormones. Journal of Biological Chemistry. 244(13):3500-3506. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)83400-7
21.
Berry, M, Edwards, Aa, Barritt, G. 1991. Isolated Hepatocytes; Preparation, Properties and Applications. Elsevier. .
Zaloguj się, aby kontynuować

Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.

Nie masz konta użytkownika?