Przygotowanie próbki do Western Blotting
Nie można wystarczająco podkreślić znaczenia dobrego przygotowania próbki. Rozumiejąc charakter próbki wyjściowej i mając jasny obraz informacji, które chcesz uzyskać z eksperymentów Western blotting, zwiększasz swoje szanse na pomyślną analizę. W związku z tym niniejszy protokół kładzie nacisk na podstawowe zasady dobrej praktyki w przygotowywaniu próbek, pomagając zapewnić, że od samego początku będzie to właściwe.
Zasadniczo wszystkie źródła białek, od pojedynczych komórek po całe tkanki, a także macierze pozakomórkowe, płyny biologiczne i białka wydzielane in vitro, są otwarte na analizę metodą Western blotting. Podczas gdy źródła takie jak komórki ssaków w zawiesinie są łatwo rozbijane w łagodnych warunkach i łatwo uwalniają swoje białka, trudniej jest wyodrębnić białka z komórek głęboko osadzonych w nienaruszonych tkankach lub w guzach litych. Ekstrakcja białek z roślin, bakterii i grzybów jest dodatkowo utrudniona przez obecność sztywnej, bogatej w węglowodany ściany komórkowej, która otacza i chroni żywą komórkę.
Niezależnie jednak od źródła i białka będącego przedmiotem zainteresowania, celem musi być opracowanie procedury ekstrakcji wystarczająco agresywnej, aby uzyskać dostęp do komórek i zakłócić ich działanie bez nieodwracalnej zmiany samych białek będących przedmiotem zainteresowania, a jednocześnie uzyskać wystarczającą wydajność materiału na akceptowalnym poziomie czystości.
Przygotowanie próbki - Bądź delikatny!
- Używaj procedur ekstrakcji, które są tak łagodne, jak to tylko możliwe: Zbyt energiczne rozerwanie komórek lub tkanek może bezpośrednio denaturować docelową cząsteczkę, tworzyć trwałe kompleksy białkowe, powodować modyfikacje chemiczne lub prowadzić do uwolnienia przedziałowych enzymów proteolitycznych.
- Ekstrahuj białka szybko, w miarę możliwości na lodzie, w obecności odpowiedniego buforu w celu utrzymania pH, siły jonowej i stabilności, aby zapobiec degradacji białek. Wstępnie schłodzić sprzęt i przechowywać próbki w lodzie przez cały czas.
Macierze biologiczne są złożone. Docelowe białko może być jednym z wielu tysięcy obecnych w próbce, oprócz kwasów nukleinowych, polisacharydów i lipidów, z których wszystkie mogą zakłócać analizę. Wysiłki włożone w ekstrakcję i oczyszczanie zależą od celu końcowego; jeśli celem jest na przykład wykrycie białka o niskiej obfitości, wskazane może być wyizolowanie powinowactwa tego konkretnego białka z próbki przy użyciu techniki takiej jak immunoprecypitacja. Z drugiej strony, analiza solidnych i obfitych białek może być zadowalająco przeprowadzona przy użyciu praktycznie natywnych próbek.
Wybór metody ekstrakcji zależy przede wszystkim od próbki i tego, czy analiza jest ukierunkowana na wszystkie białka w komórce, czy tylko na składnik z określonej frakcji subkomórkowej.
Ponadto, jako że endogenne proteazy mogą być uwalniane po rozerwaniu komórki i mogą degradować cząsteczkę docelową, próbka powinna być chroniona podczas rozerwania komórki i późniejszego oczyszczania poprzez zastosowanie koktajlu inhibitorów proteazy, aby uniknąć niekontrolowanych strat białka.
Dostępne są liczne metody rozrywania komórek i przygotowywania ich zawartości do analizy metodą Western blot. Tabela 1 zawiera listę najpopularniejszych metod ekstrakcji i wskazuje ich zastosowanie do obróbki określonych źródeł komórek lub tkanek. Ogólnie rzecz biorąc, delikatne metody są stosowane, gdy próbka składa się z łatwo lizowanych komórek hodowlanych lub komórek krwi, podczas gdy bardziej energiczne metody są stosowane do rozbijania bardziej wytrzymałych komórek bakteryjnych lub roślinnych lub komórek ssaków osadzonych w tkance łącznej.
Opcje ekstrakcji białek
Liza oparta na detergentach
Liza detergentowa jest najczęściej wybieraną metodą obróbki komórek ssaków. Zawiesiny komórek są delikatnie odwirowywane i ponownie zawieszane w roztworze lizującym zawierającym detergent. Błony są rozpuszczane, co powoduje lizę komórek i uwolnienie ich zawartości. Przylegające komórki, takie jak fibroblasty, mogą być bezpośrednio rozpuszczane na powierzchni hodowli tkankowej przez dodanie roztworu lizującego lub alternatywnie mogą być najpierw zeskrobane z powierzchni w obecności nielizującego buforu za pomocą gumowego skalpela, odwirowane i traktowane jako zawiesiny komórkowe. Zastosowanie łagodnego, niejonowego detergentu, takiego jak Triton** X-100, nonylofenoksypolietyloetanol (NP40) lub detergentu zwitterionowego, takiego jak 3-[(3-cholamidopropylo) dimetyloammonio]-1-propanosulfonian (CHAPS), pomaga zapewnić, że denaturacja białek docelowych jest ograniczona do minimum.
Liza zamrażania/rozmrażania
Metoda ta ma zastosowanie do zawiesin komórek ssaków lub bakterii. Głównymi zaletami lizy zamrażania/rozmrażania są prostota i niski koszt. Komórki są rozbijane przez wielokrotne tworzenie się kryształków lodu, a metoda ta jest zwykle łączona z lizą enzymatyczną. Zawiesinę komórek można szybko zamrozić przy użyciu ciekłego azotu. Próbka jest następnie rozmrażana i ponownie zawieszana przez pipetowanie lub delikatne worteksowanie w buforze lizującym w temperaturze pokojowej, a proces jest powtarzany kilka razy. Pomiędzy cyklami próbka jest odwirowywana, a supernatant jest zatrzymywany.
Szok osmotyczny
Jest to bardzo delikatna metoda, która może być wystarczająca do lizy zawieszonych komórek ssaków lub bakterii bez użycia detergentu. Metoda ta, często połączona z mechanicznym rozerwaniem, polega na zmianie pożywki osmotycznej z wysokiej na niską i dobrze nadaje się do zastosowań, w których lizat ma być następnie frakcjonowany na składniki subkomórkowe.
Ultrasonikacja
Ta metoda ekstrakcji białek jest najczęściej stosowana do zawiesin komórkowych. Komórki są rozbijane falami dźwiękowymi o wysokiej częstotliwości (zazwyczaj od 20 do 50 kHz) za pomocą sondy umieszczonej w próbce. Fale dźwiękowe generują obszar niskiego ciśnienia, powodując rozerwanie
błon komórkowych w pobliżu końcówki sondy. Zawiesiny komórek powinny być sonikowane w krótkich seriach, aby uniknąć nagrzewania, a próbki powinny być chłodzone lodem pomiędzy seriami. Jest to odpowiednie do przygotowywania próbek na małą skalę. Agregaty białek (ciałka inkluzyjne) muszą być rozpuszczane. Chociaż stosunkowo prosta, ultradźwięki są rygorystyczną metodą przygotowania próbek, w której generowane ciepło musi być stale utrzymywane pod kontrolą, a wrażliwe cząsteczki docelowe mogą być podatne na siły ścinające.
Uwaga: W przypadku preparatów białkowych uwalnianie DNA może prowadzić do próbek o wysokiej lepkości, które są trudne do przetworzenia. Lepkość może być zmniejszona przez dodanie DNazy.
Metody mechaniczne
Białka mogą być ekstrahowane z komórek i tkanek przy użyciu szeregu surowych, ale skutecznych środków "kruszenia i mielenia". Na przykład, błony komórkowe mogą zostać przerwane przez siły ścinające gdy próbka jest przeciskana przez wąską szczelinę: im ciaśniejsza szczelina, tym większa siła ścinająca. Można to osiągnąć ręcznie poprzez homogenizację dounce lub mechanicznie poprzez homogenizację Potter-Elvehjem. Ta łagodna metoda jest doskonała dla małych objętości i hodowanych komórek.
Homogenizacja tkanek, przygotowanych przez siekanie lub mielenie w schłodzonym buforze, może być osiągnięta przy użyciu blendera Waring lub Polytron. Polytron różni się od blendera Waring tym, że wciąga tkankę do długiego wału, który zawiera obracające się ostrza. Dostępne są wały o różnej pojemności, pozwalające na pobieranie próbek o wielkości nawet 1 ml.
Zaprawa i tłuczek: Tkanki lub komórki są zwykle zamrażane w ciekłym azocie i mielone na drobny proszek. Dodanie tlenku glinu lub piasku może pomóc w mieleniu. Ściany komórkowe są niszczone przez siłę mechaniczną.
Frezowanie szklanych kulek: Szybkie mieszanie komórek z drobnymi szklanymi kulkami rozbija ściany komórkowe. Frezowanie kulek powoduje lizę większości bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, w tym prątków gruźlicy.
Trawienie enzymatyczne
Metody enzymatyczne są często stosowane podczas ekstrakcji białek z bakterii, drożdży lub innych organizmów z błonami komórkowymi otoczonymi solidną strukturą ochronną. Enzymy rozpuszczają ściany komórkowe, płaszcze, kapsułki, kapsydy lub inne struktury, których nie można łatwo rozciąć za pomocą samych metod mechanicznych. Po trawieniu enzymatycznym często następuje homogenizacja, sonikacja lub energiczne worteksowanie w buforze lizującym. Metody enzymatyczne są najczęściej stosowane w przypadku bakterii i drożdży, ale mogą być również wykorzystywane do ekstrakcji białek z komórek eukariotycznych osadzonych w tkankach włóknistych, gdzie na przykład kolagenaza może być odpowiednia do zwiększenia rozpadu kolagenu fibrylarnego (Tabela 2).
Dekompresja wybuchowa
Ta technika jest najczęściej stosowana do bakterii, drożdży, komórek roślinnych lub innych wytrzymałych próbek. Komórki są równoważone gazem obojętnym, takim jak azot pod wysokim ciśnieniem (zwykle 5500 kPA/800 psi). Przy użyciu prasy francuskiej metoda ta działa poprzez szybki spadek ciśnienia, gdy próbka jest przenoszona z komory pod wysokim ciśnieniem przez otwór do komory pod niskim ciśnieniem. Jest to szybka i wydajna metoda, odpowiednia dla dużych objętości.
Przygotowane bufory lizujące i zestawy do przygotowania próbek
Cytiva oferuje szereg produktów do ekstrakcji białek z komórek ssaków, drożdży, bakterii i tkanek zwierzęcych.
Zestaw Sample Grinding Kit może być stosowany do rozdrabniania małych próbek tkanek i komórek w celu ekstrakcji białek. Do 100 mg próbki na probówkę można poddać obróbce w ciągu około 10 minut. Zestaw składa się z probówek do mikrowirówki, z których każda zawiera niewielką ilość ściernej żywicy mielącej zawieszonej w wodzie, oraz jednorazowych tłuczków. Probówka jest najpierw odwirowywana w celu usunięcia żywicy i wody. Następnie do probówki dodawany jest wybrany roztwór ekstrakcyjny i próbka, a tłuczek jest używany do mielenia próbki. Po odwirowaniu, szczątki komórkowe i mielona żywica są mocno osadzone w stożkowym dnie probówki, a supernatant jest łatwo usuwany
The illustra™ triplePrep™ Kit jest przeznaczony do szybkiej izolacji i oczyszczania genomowego DNA, całkowitego RNA i całkowitych zdenaturowanych białek z niepodzielonych próbek tkanek zwierzęcych i komórek ssaków. Przepływ pracy zmniejsza ogólną liczbę kroków, umożliwiając przygotowanie wszystkich trzech analitów w czasie krótszym niż 1 godz. Bufor, kolumny i protokół zapewniają wysoki odzysk z ograniczonych próbek, takich jak biopsje, zarchiwizowane tkanki i guzy.
Mammalian Protein Extraction Buffer jest przeznaczony do wydajnej i delikatnej ekstrakcji biologicznie aktywnych, całkowicie rozpuszczalnych białek z hodowanych komórek ssaków. Bufor ten jest oparty na organicznych środkach buforujących i może być stosowany zarówno do zawiesin komórkowych, jak i komórek adherentnych.
Yeast Protein Extraction Buffer Kit jest przydatny do ekstrakcji rozpuszczalnych białek z komórek drożdży i jest zastrzeżonym ulepszeniem opartego na zymolyazie przygotowania sferoplastów i ekstrakcji rozpuszczalnych białek z komórek drożdży. Zestaw ten jest dostarczany wraz z protokołem wytwarzania sferoplastów i usuwania enzymu litycznego, zymolizy, przed lizą i ekstrakcją białek drożdży. Bufor oparty jest na organicznych środkach buforujących zawierających łagodne niejonowe detergenty oraz opatentowaną kombinację różnych soli i środków zwiększających ekstrakcję i stabilność białek 28-9998-97 AB 19. Dostarczany jest również gotowy do użycia preparat Zymolyase. W zależności od zastosowania można dodać dodatkowe środki, takie jak środki redukujące, środki chelatujące i inhibitory proteazy. Zestaw buforu do ekstrakcji białek drożdży eliminuje potrzebę pracochłonnej lizy komórek drożdży za pomocą szklanych kulek.
Zestaw do frakcjonowania 2-D upraszcza analizę złożonych mieszanin białek poprzez zmniejszenie ilości i liczby gatunków białek załadowanych do matrycy żelowej. Frakcjonowanie umożliwia wyizolowanie grup białek lub frakcji z całego proteomu. Pozwala to na lepszą rozdzielczość, gdy analizowana jest pojedyncza frakcja, zapewnia mniej zatłoczone mapy 2D, upraszcza analizę i interpretację oraz zwiększa szanse na odkrycie nowych białek o znaczeniu diagnostycznym lub terapeutycznym. Te skalowalne zestawy pomagają zapewnić wysoki odzysk próbek i są kompatybilne z dalszymi technikami separacji, takimi jak elektroforeza żelowa 2D.
Ochrona próbek
Inhibitory proteaz muszą być zawarte w buforach lizujących, aby zapobiec degradacji białek po uwolnieniu endogennych proteaz podczas procesu lizy komórek.
Mieszanka inhibitorów proteaz: Przygotowanie próbek często wymaga zahamowania aktywności proteaz. Cytiva oferuje tę unikalną kombinację konkurencyjnych i niekompetycyjnych inhibitorów proteaz, które chronią białka przed proteolizą podczas oczyszczania z tkanek zwierzęcych, roślinnych, drożdży i bakterii. Koktajl, zawierający inhibitory proteaz serynowych, cysteinowych i kalpainowych, skutecznie hamuje ponad 95% aktywności proteaz i został opracowany specjalnie do przygotowywania próbek w badaniach elektroforezy żelowej 2D. Opcjonalnie można dodać kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) w celu zahamowania metaloproteaz.
Chociaż ważne jest, aby utrzymać proteazy w stanie nieaktywnym podczas ekstrakcji białek (Tabela 3), należy również wziąć pod uwagę inne potencjalnie szkodliwe zanieczyszczenia. Na przykład, jeśli celem Western blot jest wykrycie fosforylowanych białek, ważne jest, aby chronić próbkę przed działaniem defosforylującym fosfataz uwolnionych do lizatu podczas przygotowywania próbki. Jednym ze sposobów ochrony próbki jest dodanie do buforu lizującego inhibitora fosfatazy, takiego jak wanadan sodu. Konieczne może być również zabezpieczenie białek przed niepożądanymi modyfikacjami, takimi jak acetylacja, ubikwitynylacja lub glikozylacja.
Oczyszczanie próbek
Oczyszczanie próbek przed elektroforezą w żelu 1-D nie jest zwykle konieczne, ale jest bardzo ważne w przypadku elektroforezy w żelu 2-D. Jeśli jednak wystąpią problemy z separacją, takie jak rozmyte pasma, oczyszczenie próbki może poprawić wydajność poprzez usunięcie potencjalnie zakłócających związków, takich jak kwasy nukleinowe, polisacharydy i sole. Dodatek DNazy, na przykład, może być stosowany w celu przeciwdziałania problemom z lepkością spowodowanym uwalnianiem kwasów nukleinowych. Tabela 4 zawiera listę typowych zanieczyszczeń i opcji radzenia sobie z nimi.
Produkty do oczyszczania próbek
SDS-PAGE Clean-Up Kit jest przeznaczony do przygotowywania próbek, które są trudne do analizy ze względu na obecność soli lub niskie stężenie białka (Rysunek 1). Zestaw ten wykorzystuje kombinację środka strącającego i współstrącającego do ilościowego strącania białek próbki, pozostawiając w roztworze substancje zakłócające, takie jak detergenty, sole, lipidy, fenole i kwasy nukleinowe. Białka są granulowane przez odwirowanie. Pelet jest dalej płukany w celu usunięcia zanieczyszczeń niebiałkowych i ponownie odwirowywany. Powstały osad jest ponownie zawieszany, mieszany z buforem do próbek SDSPAGE i podgrzewany. Próbka jest gotowa do SDS-PAGE. Procedura może zostać zakończona w mniej niż 2 godziny.
Rysunek 1. Porównanie zestawu do oczyszczania SDS-PAGE z wytrącaniem etanolem. (A) Białko moczu wytrącone 10 objętościami etanolu. (B) Białko moczu wytrącone za pomocą zestawu SDS-PAGE Clean-Up Kit. Żel: 8 × 9 cm, 12,5% akrylamid, 0,1% SDS, uruchomiony na SE 260 Mini-Vertical Unit. Barwnik: Coomassie** Blue R-250.
2-D Clean-Up Kit jest przeznaczony do przygotowania próbek do elektroforezy żelowej 2-D (Rysunek 2), ale może być również stosowany w aplikacjach Western Blotting. Odczynniki ilościowo wytrącają białka, pozostawiając w roztworze substancje przeszkadzające, takie jak detergenty, sole, lipidy, fenole i kwasy nukleinowe. Obróbka próbki za pomocą zestawu 2-D Clean-Up Kit znacznie poprawia jakość wyników elektroforezy żelowej 2-D, redukując smugi, zabarwienie tła i inne artefakty. Więcej informacji na temat zestawu 2-D Clean-Up Kit można znaleźć w podręczniku 2-D Electrophoresis, Principles and Methods Handbook firmy Cytiva (2).
Rysunek 2.Zestaw do czyszczenia 2-D eliminuje większość poziomych smug spowodowanych przez pozostałości SDS. Próbka: Wątroba szczura ekstrahowana 4% SDS, 40 mM zasadą Tris. Pierwszy wymiar: Około 20 μg białka z wątroby szczura, Immobiline™ DryStrip (pH 4-7, 7 cm). Jednostka ogniskowania izoelektrycznego Ettan™ IPGphor™ 3 17,5 kVh. Drugi wymiar: SDS-PAGE (12,5%), prowadzony na SE 260 Mini-Vertical Unit (żel 8 × 9 cm). Barwnik: PlusOne™ Silver Staining Kit, Protein.
Usuwanie białek o wysokiej obfitości z próbek surowicy lub osocza
Podczas badania osocza lub surowicy metodą Western blot, obficie występujące białka osocza, takie jak albuminy i IgG, mogą przesłaniać sygnały mniej obfitych białek. Wstępnie zapakowane kolumny, takie jak HiTrap™ Albumin & IgG Depletion, zostały zaprojektowane w celu pozbawienia próbek tych potencjalnie problematycznych białek, usuwając odpowiednio 95% albuminy i 90% IgG.
Kolumna HiTrap Albumin & IgG Depletion 1 mL jest przeznaczona do usuwania albuminy i IgG z próbek o objętości około 150 μL nierozcieńczonego ludzkiego osocza lub surowicy, zawierających normalne poziomy albuminy (~40 mg / ml) i IgG (~15 mg / ml). Procedura wyczerpywania trwa około 35 minut i może być przeprowadzona przy użyciu systemu chromatografii cieczowej z platformy projektowej ÄKTA™, pompy perystaltycznej lub ręcznie za pomocą strzykawki. Podczas pracy z mniejszymi objętościami zaleca się stosowanie pułapki Albumin & IgG Depletion SpinTrap™, zaprojektowanej dla objętości ~50 μL ludzkiego osocza lub surowicy.
Desalting and Concentrating Samples
Przed nałożeniem próbki na żel do elektroforezy ważne jest, aby rozpuszczalnik nie zawierał nadmiernego stężenia soli lub innych zanieczyszczeń o niskiej masie cząsteczkowej. Wysoki poziom soli w próbkach może powodować migrację białek w niespójny i nieprzewidywalny sposób. Odsalanie można osiągnąć w jednym etapie w oparciu o filtrację żelową, jednocześnie przenosząc próbkę do pożądanego buforu. Jednak procedury odsalania i wymiany buforu często powodują rozcieńczenie próbki. W zastosowaniach elektroforezy do uzyskania dobrych wyników potrzebne jest stosunkowo wysokie stężenie próbki, dlatego konieczne może być jej zagęszczenie. Próbkę można skutecznie i łatwo zatężyć za pomocą ultrafiltracji membranowej.
Niektóre produkty do odsalania i zatężania dostarczane przez Cytiva zostały podsumowane w Tabeli 5.
Określenie całkowitego stężenia białka
Przy porównywaniu ilości białka z próbek pobranych z różnych pasów w tym samym żelu lub między żelami, bardzo ważne jest, aby wszystkie pasy zostały obciążone taką samą całkowitą ilością białka. Dwukrotny wzrost poziomu ekspresji określonego białka w jednym pasie zostanie całkowicie zamaskowany, jeśli pas porównawczy zawiera dwa razy więcej białka całkowitego (lub nawet będzie wydawać się, że ekspresja jest zmniejszona, jeśli pas porównawczy zawiera więcej niż dwa razy więcej).
W celu określenia stężenia białka w roztworze rutynowo stosuje się kilka metod spektrofotometrycznych (3). Obejmują one pomiar wewnętrznej absorbancji białka w ultrafiolecie (UV), a także metody oparte na zmianie koloru zależnej od białka, takie jak klasyczny, oparty na miedzi test Lowry'ego (4), test miedzi/bicynchoniny Smitha (BCA) (5) i test barwnika Bradforda (6). Chociaż szeroko stosowane, żadna z tych procedur nie jest szczególnie wygodna.
Na przykład absorbancja UV wymaga dostępu do czystego białka o znanym współczynniku ekstynkcji, w roztworze wolnym od substancji zakłócających (absorbujących promieniowanie UV). Przybliżone stężenie białka w roztworze (przy założeniu użycia kuwety o długości ścieżki 1 cm) można oszacować za pomocą jednego z poniższych równań;
A280 = 1 A1 (mL/cm mg) × [Conc.] (mg/mL) × 1 (cm)
A205 = 31 A1 (mL/cm mg) × [Conc.(mg/cm mg) × 1 (cm)
1 A280 reprezentuje światło absorbowane przez białka przy 280 nm, głównie w wyniku obecności aminokwasów pierścieniowych tyrozyny i tryptofanu. A205 reprezentuje światło absorbowane przez białka przy 205 nm, głównie w wyniku wiązań peptydowych między aminokwasami.
Różne białka mają jednak bardzo różne współczynniki ekstynkcji zarówno przy 280, jak i 205 nm, a uzyskane w ten sposób szacunki stężenia są w najlepszym razie przybliżone. Absorbancja UV wymaga, aby roztwór białka był wolny od innych substancji pochłaniających promieniowanie UV, takich jak kwasy nukleinowe, a pomiary były przeprowadzane przy użyciu kuwety kwarcowej.
Testy miedzi/BCA opierają się na redukcji Cu2+ do Cu+ przez amidy. Chociaż testy te są dość dokładne, wymagają świeżo przygotowanych roztworów odczynników, które muszą być dokładnie odmierzane i mieszane podczas testu. Po tym następuje długa, precyzyjnie zaplanowana inkubacja w ściśle kontrolowanych, podwyższonych temperaturach, a następnie natychmiastowe pomiary absorbancji. Na oba testy mogą mieć wpływ inne substancje często obecne w roztworach biochemicznych, w tym detergenty, lipidy, bufory i środki redukujące (3). Wymaga to, aby testy obejmowały również serię roztworów wzorcowych, z których każdy ma inne, znane stężenie białka, ale poza tym ma taki sam skład jak roztwory próbki.
Test barwnika Bradford opiera się na równowadze między trzema formami barwnika Coomassie Blue G. W warunkach silnie kwaśnych barwnik jest najbardziej stabilny w postaci podwójnie protonowanej (czerwonej). Po związaniu z białkiem jest jednak najbardziej stabilny w formie nieprotonowanej (niebieskiej).
W porównaniu z innymi testami opisanymi powyżej, test barwnika Bradford jest szybszy, obejmuje mniej etapów mieszania, nie wymaga ogrzewania i daje bardziej stabilną odpowiedź kolorymetryczną. Test jest jednak podatny na wpływ źródeł niebiałkowych, w szczególności detergentów, i staje się stopniowo mniej liniowy na wysokim końcu użytecznego zakresu stężeń białka. Odpowiedź zmienia się również w zależności od struktury białka.
Odczynnik barwnikowy Bradford reaguje głównie z resztami argininy i, w mniejszym stopniu, z histydyną, lizyną, tyrozyną, tryptofanem i resztami fenyloalaniny. Test jest zatem mniej dokładny w przypadku białek zasadowych lub kwaśnych i jest bardziej wrażliwy na albuminę surowicy bydlęcej niż "przeciętne" białka, około dwukrotnie. IgG jest preferowanym wzorcem białka dla testu barwnikowego Bradford.
Produkty do oznaczania stężenia białka całkowitego
Użycie spektrofotometrów UV/widzialnych jest szeroko rozpowszechnione w analizie białek. Na przykład seria spektrofotometrów Ultrospec™ firmy Cytiva obejmuje moduły do oznaczania białek, kinetyki aktywności enzymów, kwantyfikacji DNA i RNA oraz analizy frakcji. Urządzenia te są kompatybilne z tradycyjnymi metodami oznaczania białek opisanymi powyżej. Urządzenia są wyposażone w ośmiopozycyjny zmieniacz próbek i są optymalne do oznaczania stężenia białka za pomocą zestawu 2-D Quant Kit.
Ponadto spektrofotometr widzialny Novaspec™ Plus posiada zapisane metody oznaczania stężenia białka za pomocą testu barwnikowego Bradforda, testów BCA, Biureta i Lowry'ego, a także podstawowe tryby absorbancji, transmitancji, OD600 i stężenia.
2-D Quant Kit, pomimo swojej nazwy, może być używany w wielu różnych zastosowaniach, w tym do dokładnego oznaczania stężenia białka w próbkach. Procedura działa poprzez ilościowe wytrącanie białek przy jednoczesnym pozostawieniu substancji zakłócających. Test opiera się na specyficznym wiązaniu jonów miedzi z szkieletem polipeptydowym każdego obecnego białka. Wytrącone białka są ponownie zawieszane w roztworze zawierającym miedź, a niezwiązana miedź jest mierzona za pomocą środka kolorymetrycznego. Absorbancja przy 480 nm jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia białka. Test ma liniową odpowiedź na stężenie białka w zakresie od 0 do 50 μg/ml, przy użyciu zalecanej objętości próbki od 1 do 50 μl. Ponadto zestaw 2-D Quant Kit jest kompatybilny z większością odczynników stosowanych w wielu opisanych technikach przygotowania próbek, takich jak SDS.
**Znak towarowy strony trzeciej
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?