Koniugat przeciwciał i leków umożliwia rozwój metod LC-MS bez ryzyka
Kevin Ray, Ben Cutak, Brian Gau
MilliporeSigma, St. Louis, MO
Przegląd
Nietoksyczny ADC-mimetyk sprzężony z Cys, scharakteryzowany metodami LC-MS top-down, middle-out i bottom-up.
Wprowadzenie
ADC sprzężone w resztach Cys międzyłańcuchowych wiązań dwusiarczkowych dają mAbs zawierające 0-4 par łączników leków. Scharakteryzowanie tego rozkładu ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia skuteczności ADC i kontroli procesu. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób metody LC i MS mogą być zoptymalizowane przy użyciu nietoksycznego surogatu ADC, "ADC-mimic", który zachowuje się bardzo podobnie do ADC Adcetris (Seattle Genetics). Jego łącznik mimiczny dansylo-kadaweryny SMCC nadaje przesunięcie masy o 668 Da po sprzężeniu z resztami Cys.

Rysunek 1.
Metody
Natywne i zredukowane metody SEC-MS wykorzystywały deglikozylację z całonocną obróbką PNGazą F. Redukcja SEC-MS obejmowała 100 mM DTT w temperaturze 37 °C. Metody RPLC-MS (z i bez IdeS) wykorzystywały ostrzejszą redukcję: 7,4 M GndCl i 100 mM DTT w temperaturze 50 °C. Metoda mapowania peptydów wykorzystywała przepływ pracy FASP Trypsin/LysC z alkilacją przez IAA. Acquity-Xevo G2 QToF klasy M (Waters) został użyty we wszystkich metodach z wyjątkiem zredukowanej (nie-IdeS) RPLC-MS, która wykorzystywała Acquity-QToF Premier.
Wyniki

Rysunek 2.Natywne widmo SEC-MS naśladujące ADC. DAR jest ważoną sumą intensywności pików z adnotacjami. Chromatografia: izokratyczna 100 mM NH4CH3CO2, 70 μL/min, 2 mm x 30 cm TSK Gel SW3000XL.

Rysunek 3.Zredukowane widma SEC-MS ADC-mimic i Adcetris. Każdy DAR jest 2x sumą ważonych sum intensywności pików koniugatu łańcucha ciężkiego i lekkiego. Chromatografia: izokratyczna 30% ACN/0,1% TFA, 70 μL/min, 2 mm x 30 cm TSK Gel SW3000XL.

Rysunek 4.Mapowanie peptydów Adcetris i ADC-mimic. Czerwone i niebieskie adnotacje oznaczają odpowiednio sprzężone i niesprzężone peptydy. Zajętość miejsca jest określana na podstawie obszarów pików XIC. Chromatografia: organiczna 3% - 57% / 2 h, 10 μL/min, 300 μm x 15 cm BIOshell C18 x 2.

Rysunek 5.RPLC zredukowanego MAb i ADC-mimic. Wzorzec MAb (MSQC4) jest składnikiem MAb mimetyku ADC. Chromatografia: desalt przy 5% organicznym → 29% - 42% / 13 min, 300 μL/min, 2,1 mm ID x 15 cm BIOshell C4.

Rysunek 6.RPLC i widma Fab' dla IdeS/reduced MAb Standard i ADC-mimic. Chromatografia: desalt przy 5% organicznym → 31,3% - 32,5% / 4 min → 35% - 38% / 10 min, 40 μL/min, 300 μm x 15 cm BIOshell C4.
Wnioski
Opracowaliśmy nietoksyczny ADC-mimetyk z koniugacją Cys do dansylokadaweryny-SMCC. Dzięki natywnemu i zredukowanemu SEC-MS, jego DAR jest porównywalny do Adcetris. Hydrofobowość nadana przez mimetyk jest podobna do wysoce hydrofobowego łącznika MMAE Adcetris. Metody bottomup, top-down i middle-out pokazane tutaj dla ADC-mimic można przetłumaczyć na charakterystykę innych ADC sprzężonych z Cys.
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?