Protokół redukcji DDT oligonukleotydów modyfikowanych tiolem

Redukcja wiązań disulfidowych

Niniejszy protokół służy do redukcji wiązań disulfidowych oligonukleotydów modyfikowanych tiolami do aktywnej formy sulfhydrylowej (rysunek 1). Grupy sulfhydrylowe mogą być wykorzystywane do przyłączania oligonukleotydów do powierzchni stałych, takich jak nanocząstki złota. Redukcja wiązań dwusiarczkowych przy użyciu ditiotreitolu (DTT), znanego również jako odczynnik Clelanda, również chroni przed dimeryzacją starterów.

Rysunek 1. Przykład redukcji wiązania disulfidowego oligonukleotydu 5'-Tiol-Modifier C6 S-S. Oligonukleotydy modyfikowane tiolem są dostarczane w postaci disulfidowej, aby zapobiec spontanicznemu, niekontrolowanemu utlenianiu, które z kolei prowadziłoby do tworzenia dimerów, czyniąc oligonukleotyd bezużytecznym.

Dostawy

• 2 ml probówki wirówkowe
• końcówki do pipet
• Milli-Q^® H₂O
• DTT (D9779)
• NAP™-10 (GE17-0854-01)
• Bufor fosforanu sodu
• Modyfikowany tiolem oligonukleotyd

Metoda

Metoda podzielona jest na dwa główne etapy: 1) tworzenie sulfhydrylu i 2) usuwanie produktów ubocznych.

Tworzenie sulfhydrylu

1. Przygotuj 100 mM roztwór DTT w 100 mM buforze fosforanu sodu, pH 8,3 - 8,5. Dla 5 ml, rozpuścić 77,13 mg DTT w buforze.
2. Dla gęstości optycznej do 12,5 OD (jednostki gęstości optycznej; dla 12,5 OD, utrzymywać stosunek 10:1 roztworu DTT do OD oligonukleotydu), rozpuścić zmodyfikowany tiolem oligonukleotyd w 125 µL roztworu DTT.
3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.

Usuwanie produktów ubocznych

1. Wyrównać kolumnę NAP-10 za pomocą około 15 mL 100 mM buforu fosforanu sodu, pH 6.0. Pozwól buforowi wyrównawczemu całkowicie wniknąć do złoża żelowego.
2. Dodaj 1,0 ml mieszaniny reakcyjnej do kolumny NAP-10 (w razie potrzeby zwiększ objętość mieszaniny reakcyjnej do 1,0 ml za pomocą buforu fosforanu sodu o pH 6,0). Pozostawić mieszaninę reakcyjną do całkowitego wprowadzenia do złoża żelowego.
3. Elutować oligonukleotyd zmodyfikowany tiolem do probówki wirówkowej z 1,0 ml buforu fosforanu sodu, pH 6,0.

.

Uwagi dodatkowe

Przygotować bufor fosforanu sodu, zarówno o pH 8,3 - 8,5, jak i 6,0, zgodnie ze standardowymi praktykami laboratoryjnymi. Wszystkie bufory należy przygotować z użyciem wody Milli-Q^®.