Zalecana standardowa metoda izolacji komórek jednojądrzastych

Rozdzielanie komórek przy użyciu produktów Ficoll-Paque może być przeprowadzane w szerokim zakresie objętości próbek krwi. Dzięki wysokiej wydajności, metoda ta może być dostosowana do przetwarzania bardzo małych ilości krwi, takich jak krew pobrana od dzieci. W celu uzyskania maksymalnej powtarzalności rozdziału zaleca się stosowanie znormalizowanej procedury. Poniższa procedura została oceniona w naszych laboratoriach przy użyciu Ficoll-Paque PLUS i jest zalecana do oddzielania normalnych próbek krwi. Proste zmiany można łatwo wprowadzić w celu dostosowania do konkretnego systemu wirowania. Ta sama procedura jest zalecana podczas oddzielania komórek przy użyciu Ficoll-Paque PREMIUM, Ficoll-Paque PREMIUM 1.084 i Ficoll-Paque PREMIUM 1.073.

Aby ujednolicić technikę, należy najpierw wybrać objętość krwi i średnicę rurki wirówki. Czynniki te określają wysokość próbki krwi w probówce, a w konsekwencji czas wirowania. Zwiększenie wysokości próbki krwi w probówce zwiększa zanieczyszczenie czerwonych krwinek. Zmiana średnicy probówki nie ma jednak znaczącego wpływu na separację. Stąd większa objętość może być oddzielona z tym samym stopniem oczyszczenia w probówce o większej średnicy, jeśli wysokość próbki krwi w probówce i czas separacji są utrzymywane na stałym poziomie.

Wydajność i stopień czystości komórek jednojądrzastych zależą w znacznym stopniu od skuteczności usuwania czerwonych krwinek.

Kiedy erytrocyty w pełnej krwi są agregowane, niektóre komórki jednojądrzaste są uwięzione w grudkach i dlatego osadzają się wraz z erytrocytami. Ta tendencja do zatrzymywania komórek jednojądrzastych jest zmniejszana przez rozcieńczenie krwi. Rozcieńczenie zapewnia lepszą wydajność komórek jednojądrzastych i zmniejsza rozmiar grudek czerwonych krwinek. Agregacja erytrocytów nasila się w wyższych temperaturach (37 °C), co w konsekwencji zmniejsza wydajność komórek jednojądrzastych. W niższych temperaturach (4 °C) szybkość agregacji jest zmniejszona, ale czas oddzielania jest wydłużony, co również zmniejsza wydajność komórek jednojądrzastych. Kompromisowa temperatura od 18 °C do 20 °C daje optymalne wyniki.

Sprzęt i roztwory wymagane, ale niedostarczone

1. Sterylny zrównoważony roztwór soli lub inne standardowe roztwory soli (patrz Przygotowanie odczynników).
2. Wirówka z wirnikiem uchylnym (hamulec powinien być wyłączony).
3. Jałowe probówki wirówkowe i pipety.
4. Jałowe igły i strzykawki.
5. Wybrany roztwór do lizy czerwonych krwinek (w przypadku izolacji granulocytów).

Przygotowanie odczynników

Rozcieńczalnik i roztwór płuczący
Zrównoważony roztwór soli do rozcieńczania krwi i płukania komórek można przygotować zgodnie z poniższą instrukcją. Inne rozcieńczalniki i płyny do płukania, takie jak izotoniczna sól fizjologiczna buforowana Ca²⁺/Mg²⁺ (np. PBS Dulbecco), roztwory soli (np. Hanka) lub pożywki do hodowli komórkowych (np. RPMI 1640) mogą być również stosowane, RPMI 1640).

Zrównoważony roztwór soli
Aby przygotować zrównoważony roztwór soli, zmieszaj jedną objętość roztworu podstawowego A z dziewięcioma objętościami roztworu podstawowego B i wysterylizuj. Dla każdej próbki należy przygotować co najmniej 20 ml. Można również użyć innych sterylnych standardowych roztworów soli.

Roztwór A	Stężenie (M)	Stężenie (g/L)
D-glukoza bezwodna	5.5 × 10-3 M (0,1%)	1,0
CaCl2.2H2O	5.0 × 10-5 M	0.0074
MgCl2.6H20	9.8 × 10-4 M	0.1992
KCl	5.4 × 10-3 M	0.4026
TRIS	0.145 M	17.565

Rozpuścić w około 950 ml wody destylowanej i dodać stężony HCl do uzyskania pH 7,6, a następnie dostosować objętość do 1 litra.

Roztwór B	Stężenie (M)	Stężenie (g/L)
NaCl	0.14	8.19

Aby przygotować zrównoważony roztwór soli, zmieszaj 1 objętość roztworu A z 9 objętościami roztworu B. Przygotowuj roztwór świeżo co tydzień. Można użyć innych standardowych roztworów soli.

Produkt Ficoll-Paque
Przed użyciem podgrzej nośnik gradientu gęstości Ficoll-Paque do temperatury od 18 °C do 20 °C. W przypadku próbek większych niż 3 ml, patrz Uwagi.

Przygotowanie próbki
Należy użyć świeżej krwi, aby zapewnić wysoką żywotność wyizolowanych komórek jednojądrzastych. Przygotuj próbkę w temperaturze od 18°C do 20°C.

1. Do probówki wirówkowej o pojemności 10 ml dodaj 2 ml krwi poddanej defibrylacji lub działaniu antykoagulantu i taką samą objętość zbilansowanego roztworu soli (końcowa objętość 4 ml).
2. Wymieszaj krew i bufor, kilkakrotnie odwracając probówkę lub pobierając mieszaninę do i z pipety.

Procedura izolacji komórek jednojądrzastych

1. Odwróć butelkę z podłożem Ficoll-Paque kilka razy, aby zapewnić dokładne wymieszanie.
   W celu pobrania pożywki Ficoll-Paque za pomocą strzykawki: Zdejmij polipropylenową nasadkę i włóż igłę strzykawki przez przegrodę (Rysunek 1).
   W celu pobrania pożywki Ficoll-Paque za pomocą pipety: Zdejmij polipropylenową nasadkę. Podnieś aluminiowy pierścień. Zdejmij metalową uszczelkę. Zdejmij srebrny pierścień.
   Zdejmij gumowe zamknięcie. Stosując techniki aseptyczne, pobierz wymaganą objętość pożywki Ficoll-Paque (Rysunek 2).
2. Dodaj pożywkę Ficoll-Paque (3 ml) do probówki wirówkowej.
3. Ostrożnie nałóż rozcieńczoną próbkę krwi (4 ml) na roztwór pożywki Ficoll-Paque (Rysunek 3).
   Ważne:  Podczas nakładania próbki nie mieszaj roztworu pożywki Ficoll-Paque i rozcieńczonej próbki krwi.
4. Wirować z prędkością 400 g przez 30 do 40 minut w temperaturze od 18°C do 20°C (hamulec powinien być wyłączony).
5. Odciągnąć górną warstwę zawierającą osocze i płytki krwi za pomocą sterylnej pipety, pozostawiając warstwę komórek jednojądrzastych nienaruszoną na granicy faz (Rysunek 4 i Rysunek 5). Górna warstwa zawierająca osocze może zostać zachowana do późniejszego wykorzystania.
6. Przenieś warstwę komórek jednojądrzastych do sterylnej probówki wirówkowej za pomocą sterylnej pipety.

.

Rysunek 1. Usuwanie polipropylenowej nasadki i srebrnego pierścienia

Rysunek 2. Wycofanie nośnika Ficoll-Paque

Rysunek 3. Próbka krwi nałożona na podłoże Ficoll-Paque

Rysunek 4. Przed usunięciem górnej warstwy.

Rysunek 5. Po usunięciu górnej warstwy (plazmy).

Płukanie izolatu komórkowego

1. Oszacuj objętość przeniesionych komórek jednojądrzastych. Dodaj co najmniej 3 objętości (~ 6 ml) zbilansowanego roztworu soli do komórek jednojądrzastych w probówce wirówkowej.
2. Zawieś komórki, delikatnie wciągając i wyciągając je z pipety.
3. Wirować z prędkością od 400 do 500 × g przez 10 do 15 minut w temperaturze od 18 °C do 20 °C.

Uwaga: Wirowanie z dużą prędkością zwiększa odzysk komórek jednojądrzastych. Jednakże, jeśli ważne jest również pozbycie się płytek krwi, zaleca się niższą prędkość wirowania (60 do 100 × g).

1. Usuń supernatant.
2. Zawieś ponownie komórki jednojądrzaste w 6 do 8 ml zbilansowanego roztworu soli.
3. Wirować z prędkością od 400 do 500 × g (lub od 60 do 100 × g w celu usunięcia płytek krwi) przez 10 minut w temperaturze od 18°C do 20°C.
4. Usuń supernatant.
5. Zawieś ponownie osad komórkowy w pożywce odpowiedniej do zastosowania.

Procedura izolacji granulocytów

1. Przeprowadź wirowanie w gradiencie gęstości przy użyciu pożywki Ficoll-Paque, jak opisano powyżej w Procedura izolacji komórek jednojądrzastych, kroki od 1 do 6.
2. Odciągnij górną warstwę pożywki Ficoll-Paque za pomocą sterylnej pipety, pozostawiając nienaruszoną warstwę białych krwinek granulocytów powyżej warstwy czerwonych krwinek.
3. Zbierz cienką warstwę białych krwinek granulocytów za pomocą pipety i przenieś do sterylnej probówki wirówkowej.
4. Zawieś komórki w co najmniej pięciu objętościach zbilansowanego roztworu soli i wiruj przy 400 × g przez 15 minut.
5. Liza pozostałych czerwonych krwinek za pomocą dowolnego wybranego roztworu do lizy czerwonych krwinek.
6. Wirowanie granulocytów z prędkością 400 do 500 × g przez 10 do 15 minut w temperaturze od 18 °C do 20 °C.
7. Usuń supernatant.
8. Zawieś ponownie granulocyty w 6 do 8 ml zbilansowanego roztworu soli.
9. Wiruj przy 400 do 500 × g przez 10 minut w temperaturze od 18 °C do 20 °C.
10. Usuń supernatant.
11. Zawieś ponownie osad komórkowy w pożywce odpowiedniej do zastosowania.

.

Uwagi
Antykoagulanty: Heparyna, EDTA, cytrynian, kwaśny cytrynian dekstrozy (ACD) i cytrynian fosforan dekstrozy (CPD) mogą być stosowane jako antykoagulanty dla próbki krwi. Defibrylowana krew nie wymaga stosowania antykoagulantu. Defibrylacja skutkuje jednak niższą wydajnością komórek jednojądrzastych i może powodować zwiększone zanieczyszczenie krwinkami czerwonymi³. Powoduje również selektywną utratę monocytów.

Bøyum odkrył, że nieco czystszy preparat komórek jednojądrzastych uzyskuje się stosując EDTA zamiast heparyny jako antykoagulant³. Podczas oczyszczania komórek jednojądrzastych ze źródeł innych niż krew obwodowa zauważono również, że dodanie heparyny może powodować żelowanie zawiesin komórkowych⁴. Krew stabilizowana cytrynianem może skutkować lepszą jakością RNA i DNA niż inne antykoagulanty i dawać wyższą wydajność komórek jednojądrzastych. Heparyna wpływa na proliferację komórek T i wiąże się z wieloma białkami. EDTA jest dobry do testów opartych na DNA, ale wpływa na stężenie Mg2+ i powoduje problemy w analizie cytogenetycznej⁵. Wykazano również, że wydajność RNA jest wyższa we krwi z EDTA niż we krwi z heparyną⁶.

Objętość krwi: Większe objętości krwi mogą być przetwarzane z taką samą skutecznością separacji przy użyciu probówek wirówkowych o zwiększonej średnicy przy zachowaniu w przybliżeniu takich samych wysokości pożywki Ficoll-Paque (2,4 cm) i próbki krwi (3,0 cm), jak w standardowej metodzie opisanej powyżej. Zwiększenie średnicy probówki nie wpływa na wymagany czas separacji.

Przechowywanie próbek krwi: Próbki krwi powinny być wolne od skrzepów i przetworzone jak najszybciej po pobraniu, aby zapewnić optymalne wyniki. Opóźnienia w przetwarzaniu krwi mogą skutkować utratą żywotności, niższym odzyskiem komórek i większą ilością zanieczyszczających granulocytów i/lub erytrocytów. Rzeczywiście, stwierdzono, że przechowywanie przez 24 godziny w temperaturze pokojowej skutkuje zmniejszoną wydajnością limfocytów, zmienioną ekspresją markerów powierzchniowych i zmniejszoną odpowiedzią na stymulację mitogenną ^5,7,8. Usuwanie martwych komórek: Martwe komórki są usuwane podczas izolacji komórek przy użyciu Ficoll-Paque PLUS^9,10,58.

Gęstość i temperatura: Na temperaturę, w której przeprowadzane są separacje w gradiencie gęstości, naturalnie wpływa temperatura pokojowa, temperatura wirówki, temperatura pożywki gradientu gęstości i temperatura ciekłej próbki. Czasami może również wystąpić nieporozumienie co do tego, co oznacza temperatura pokojowa (np. w Europie może to być 20ºC, a w Ameryce Północnej 20ºC). Wiadomo, że gęstość produktów Ficoll-Paque zmniejsza się wraz ze wzrostem temperatury. Na przykład Ficoll-Paque PREMIUM (1,077 g/ml) wykazuje gęstość 1,0772, 1,0767 i 1,0758 odpowiednio w 20ºC, 22ºC i 25ºC.

Patologiczne próbki krwi: Standardowa metoda opisana powyżej została opracowana do oczyszczania komórek jednojądrzastych z krwi obwodowej normalnych, zdrowych, ludzkich dawców. Inne wyniki można uzyskać w przypadku próbek pobranych od dawców z infekcjami lub innymi stanami patologicznymi, takimi jak nowotwory (patrz Dalsze zastosowania Ficoll-Paque PLUS i Ficoll-Paque PREMIUM, strona 12).

Usuwanie płytek krwi: Jeśli ważne jest usunięcie wszystkich płytek krwi z frakcji komórek jednojądrzastych, można zastosować drugie wirowanie w gradiencie od 4% do 20% sacharozy nałożonym na Ficoll-Paque PLUS. Procedura ta skutecznie usunie wszelkie zanieczyszczenia płytkowe¹¹. Płytki krwi pozostaną w górnej części gradientu sacharozy, a komórki jednojądrzaste będą sedymentować przez gradient sacharozy do górnej części warstwy Ficoll-Paque PLUS. Alternatywnie, płytki krwi można usunąć poprzez agregację z adenozyno-5'-difosforanem (ADP) przed oddzieleniem komórek jednojądrzastych¹².

Rozwiązywanie problemów związanych z nieodpowiednią wydajnością
Jeśli preparaty Ficoll-Paque PLUS i Ficoll-Paque PREMIUM są stosowane zgodnie z zalecaną procedurą standardową, można oczekiwać, że zapewnią bezproblemową izolację ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z wynikami przedstawionymi na stronie 2. Jak wspomniano wcześniej, Ficoll-Paque PREMIUM 1.073 i Ficoll-Paque PREMIUM 1.084 prowadzą do izolacji preparatów komórkowych o nieco innej gęstości podzbiorów komórek jednojądrzastych. Jednak odchylenia w niektórych parametrach eksperymentalnych mogą prowadzić do słabych wyników, a podana tutaj tabela rozwiązywania problemów ma na celu pomóc w szybkiej identyfikacji i korekcie problemu powodującego obniżoną wydajność.

Odchylenie w wydajności	Prawdopodobne źródło problemu	Komentarze
Podwyższony poziom czerwonych krwinek i zanieczyszczenie limfocytów.	A. Zbyt niska temperatura.	Gęstość wszystkich produktów Ficoll-Paque jest większa w niskiej temperaturze (patrz Uwagi, Gęstość i temperatura), a czerwone krwinki są słabiej agregowane, więc granulocyty i czerwone krwinki nie mogą dostać się do warstwy nośnika Ficoll-Paque. Podnieść temperaturę do 18-20°C.
	B. Zbyt niska prędkość wirowania i/lub zbyt krótki czas wirowania.	W celu zapewnienia pełnej sedymentacji komórek innych niż limfoidalne należy zastosować odpowiedni czas i siłę g.
Niska wydajność i żywotność komórek jednojądrzastych.	Zbyt wysoka temperatura.	Produkty Ficoll-Paque są mniej gęste w wysokiej temperaturze i niektóre limfocyty mogą przenikać do warstwy nośnika Ficoll-Paque. Może to również wpłynąć na żywotność komórek. Zmniejsz temperaturę do 18-20°C.
Niska wydajność komórek jednojądrzastych o normalnej żywotności.	Krew nierozcieńczona w stosunku 1:1 zrównoważonym roztworem soli; nietypowo wysoki hematokryt.	Wysoka gęstość komórek powoduje, że duża liczba limfocytów jest uwięziona przez agregaty czerwonych krwinek. Dalsze rozcieńczanie próbki krwi.
Niska wydajność komórek jednojądrzastych ze zwiększonym zanieczyszczeniem granulocytami.	Wibracje rotora wirówki, prowadzące do mieszania gradientu.	Wibracje mogą powodować poszerzenie pasma komórek jednojądrzastych i mieszanie z komórkami leżącymi poniżej. Sprawdź, czy rotor jest prawidłowo wyważony. Wybierz prędkość wirnika, aby uniknąć naturalnych częstotliwości rezonansowych.
Niska wydajność komórek jednojądrzastych, niska żywotność i zanieczyszczenie innymi typami komórek.	Próbka zawiera komórki o nienormalnej gęstości; gęstości inne niż w normalnej ludzkiej krwi.	Może występować w przypadku patologicznych próbek krwi, próbek krwi pochodzących od osób innych niż ludzie, starych próbek krwi lub próbek pochodzących ze źródeł innych niż krew obwodowa. Percoll™ PLUS, pożywka do wirowania w gradiencie gęstości, może być bardziej odpowiednia niż produkty Ficoll-Paque do takich separacji.

Referencje

1. Böyum A. 1968. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 9777-89.

2. Böyum A. 1968. Isolation of leucocytes from human blood – further observations. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 9731–50.

3. BØYUM A. 1976. Isolation of Lymphocytes, Granulocytes and Macrophages. 59-15. https://doi.org/10.1111/j.1365-3083.1976.tb03851.x

4. Almeida AP, A. Beaven M. 1980. Gel formation with leucocytes and heparin. Life Sciences. 26(7):549-555. https://doi.org/10.1016/0024-3205(80)90318-5

5. Holland NT, Smith MT, Eskenazi B, Bastaki M. 2003. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 543(3):217-234. https://doi.org/10.1016/s1383-5742(02)00090-x

6. Marteau J, Mohr S, Pfister M, Visvikis-Siest S. 2005. Collection and Storage of Human Blood Cells for mRNA Expression Profiling: A 15-Month Stability Study. 51(7):1250-1252. https://doi.org/10.1373/clinchem.2005.048546

7. Kaplan J, Nolan D, Reed A. 1982. Altered lymphocyte markers and blastogenic responses associated with 24 hour delay in processing of blood samples. Journal of Immunological Methods. 50(2):187-191. https://doi.org/10.1016/0022-1759(82)90224-1

8. Imeri F, Herklotz R, Risch L, Arbetsleitner C, Zerlauth M, Risch GM, Huber AR. 2008. Stability of hematological analytes depends on the hematology analyser used: A stability study with Bayer Advia 120, Beckman Coulter LH 750 and Sysmex XE 2100. Clinica Chimica Acta. 397(1-2):68-71. https://doi.org/10.1016/j.cca.2008.07.018

9. Paietta E. 2003. How to optimize multiparameter flow cytometry for leukaemia/lymphoma diagnosis. Best Practice & Research Clinical Haematology. 16(4):671-683. https://doi.org/10.1016/s1521-6926(03)00070-7

10. Dolan BP, Gibbs KD, Ostrand-Rosenberg S. 2006. Dendritic Cells Cross-Dressed with Peptide MHC Class I Complexes Prime CD8+ T Cells. J Immunol. 177(9):6018-6024. https://doi.org/10.4049/jimmunol.177.9.6018

11. Perper RJ, Zee TW, Mickelson MM. 1968. Purification of lymphocytes and platelets by gradient centrifugation. J Lab Clin Med. 72(5):842-8.

12. VIVES J, PARRA M, CASTILLO R. Platelet Aggregation Technique Used in the Preparation of Lymphocyte Suspensions. 1(6):276-278. https://doi.org/10.1111/j.1399-0039.1971.tb00106.x

13. Alexander EL, Titus JA, Segal DM. 1978. Quantitation of Fc receptors and surface immunoglobulin is affected by cell isolation procedures using plasmagel and Ficoll-Hypaque. Journal of Immunological Methods. 22(3-4):263-272. https://doi.org/10.1016/0022-1759(78)90034-0

14. Hokland P, Heron I. 1980. Analysis of the lymphocyte distribution during isopaque-ficoll isolation of mononuclear cells from human peropheral blood. Journal of Immunological Methods. 32(1):31-39. https://doi.org/10.1016/0022-1759(80)90114-3

15. HOKLAND P, HERON I. 1980. The Isopaque-Ficoll Method Re-evaluated: Selective Loss of Autologous Rosette-forming Lymphocytes during Isolation of Mononuclear Cells from Human Peripheral Blood. Scand J Immunol. 11(3):353-356. https://doi.org/10.1111/j.1365-3083.1980.tb00245.x

16. AssumpcióRomeu M, Mestre M, González L, Valls A, Verdaguer J, Corominas M, Bas J, Massip E, Buendia E. 1992. Lymphocyte immunophenotyping by flow cytometry in normal adults. Journal of Immunological Methods. 154(1):7-10. https://doi.org/10.1016/0022-1759(92)90206-9

17. Lin S, Chao H, Yan D, Huang Y. 2002. Expression of adhesion molecules on T lymphocytes in young children and infants - a comparative study using whole blood lysis or density gradient separation. Clin Lab Haematol. 24(6):353-359. https://doi.org/10.1046/j.1365-2257.2002.00462.x

18. Bain B, Pshyk K. 1973. Reactivity in mixed cultures of mononuclear leucocytes separated on Ficoll-Hypaque. Proceedings 7th Leucocyte Culture Conference; New York Academic Press. p. 29–37.

19. Wu Y, Lu H, Cai J, He X, Hu Y, Zhao H, Wang X. 2009. Membrane Surface Nanostructures and Adhesion Property of T Lymphocytes Exploited by AFM. Nanoscale Res Lett. 4(8):942-947. https://doi.org/10.1007/s11671-009-9340-8

20. Guia S, Cognet C, de Beaucoudrey L, Tessmer MS, Jouanguy E, Berger C, Filipe-Santos O, Feinberg J, Camcioglu Y, Levy J, et al. 2008. A role for interleukin-12/23 in the maturation of human natural killer and CD56+ T cells in vivo. 111(10):5008-5016. https://doi.org/10.1182/blood-2007-11-122259

21. Frelin C. 2005. Targeting NF- B activation via pharmacologic inhibition of IKK2-induced apoptosis of human acute myeloid leukemia cells. Blood. 105(2):804-811. https://doi.org/10.1182/blood-2004-04-1463

22. van den Akker ELT, Baan CC, van den Berg B, Russcher H, Joosten K, Hokken-Koelega ACS, Lamberts SWJ, Koper JW. 2008. Ficoll-separated mononuclear cells from sepsis patients are contaminated with granulocytes. Intensive Care Med. 34(5):912-916. https://doi.org/10.1007/s00134-007-0989-0

23. Chan JK, Hamilton CA, Anderson EM, Cheung MK, Baker J, Husain A, Teng NN, Kong CS, Negrin RS. 2007. A novel technique for the enrichment of primary ovarian cancer cells. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197(5):507.e1-507.e5. https://doi.org/10.1016/j.ajog.2007.05.006

24. Kluin-Nelemans JC, van-Helden HP. 1980. Non-lymphoid cells obtained by the Böyum technique and their significance in cancer patients. J Clin Lab Immunol. 4(2):99-102.

25. Minami R, Yokota S, Teplitz RL. 1978. Gradient separation of normal and malignant cells. II. Application to in vivo tumor diagnosis. Acta Cytol. 22(6):584-8.

26. Chang H, Jones OW, Bradshaw C, Sarkar S, Porreco RP. 1981. Enhancement of human amniotic cell growth by ficoll-paque gradient fractionation. In Vitro. 17(1):81-90. https://doi.org/10.1007/bf02618035

27. Kekarainen T, Mannelin S, Laine J, Jaatinen T. 2006. BMC Cell Biol. 7(1):30. https://doi.org/10.1186/1471-2121-7-30

28. Briquet A, Dubois S, Bekaert S, Dolhet M, Beguin Y, Gothot A. 2010. Prolonged ex vivo culture of human bone marrow mesenchymal stem cells influences their supportive activity toward NOD/SCID-repopulating cells and committed progenitor cells of B lymphoid and myeloid lineages. Haematologica. 95(1):47-56. https://doi.org/10.3324/haematol.2009.008524

29. Malanga D, Barba P, Harris PE, Maffei A, Del Pozzo G. 2007. The active translation of MHCII mRNA during dendritic cells maturation supplies new molecules to the cell surface pool. Cellular Immunology. 246(2):75-80. https://doi.org/10.1016/j.cellimm.2007.06.003

30. Ciccocioppo R, Ricci G, Rovati B, Pesce I, Mazzocchi S, Piancatelli D, Cagnoni A, Millimaggi D, Danova M, Corazza GR. Reduced number and function of peripheral dendritic cells in coeliac disease. 149(3):487-496. https://doi.org/10.1111/j.1365-2249.2007.03431.x

31. Hattar K, van Bürck S, Bickenbach A, Grandel U, Maus U, Lohmeyer J, Csernok E, Hartung T, Seeger W, Grimminger F, et al. 2005. Anti-proteinase 3 antibodies (c-ANCA) prime CD14-dependent leukocyte activation. Journal of Leukocyte Biology. 78(4):992-1000. https://doi.org/10.1189/jlb.0902442

32. Lubin I, Faktorowich Y, Lapidot T, Gan Y, Eshhar Z, Gazit E, Levite M, Reisner Y. 1991. Engraftment and development of human T and B cells in mice after bone marrow transplantation. Science. 252(5004):427-431. https://doi.org/10.1126/science.1826797

33. Flaherty MP, Abdel-Latif A, Li Q, Hunt G, Ranjan S, Ou Q, Tang X, Johnson RK, Bolli R, Dawn B. 2008. Noncanonical Wnt11 Signaling Is Sufficient to Induce Cardiomyogenic Differentiation in Unfractionated Bone Marrow Mononuclear Cells. Circulation. 117(17):2241-2252. https://doi.org/10.1161/circulationaha.107.741066

34. Kawka DW, Ouellet M, Hétu P, Singer II, Riendeau D. 2007. Double-label expression studies of prostacyclin synthase, thromboxane synthase and COX isoforms in normal aortic endothelium. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1771(1):45-54. https://doi.org/10.1016/j.bbalip.2006.09.015

35. Zhang Y, Lin H, Frimberger D, Epstein RB, Kropp BP. 2005. Growth of bone marrow stromal cells on small intestinal submucosa: an alternative cell source for tissue engineered bladder. BJU Int. 96(7):1120-1125. https://doi.org/10.1111/j.1464-410x.2005.05741.x

36. Yang G, Qiu C, Zhao H, Liu Q, Shao Y. 2006. Expression of mRNA for multiple serotonin (5-HT) receptor types/subtypes by the peripheral blood mononuclear cells of rhesus macaques. Journal of Neuroimmunology. 178(1-2):24-29. https://doi.org/10.1016/j.jneuroim.2006.05.016

37. Xu R, Jiang X, Guo Z, Chen J, Zou Y, Ke Y, Zhang S, Li Z, Cai Y, Du M, et al. 2008. Functional Analysis of Neuron-like Cells Differentiated from Neural Stem Cells Derived from Bone Marrow Stroma Cells in vitro. Cell Mol Neurobiol. 28(4):545-558. https://doi.org/10.1007/s10571-007-9174-9

38. Pearson TW, Roelants GE, Lundin LB, Mayor-Withey KS. 1979. The bovine lymphoid system: Binding and stimulation of peripheral blood lymphocytes by lectins. Journal of Immunological Methods. 26(3):271-282. https://doi.org/10.1016/0022-1759(79)90252-7

39. Yang TJ, Jantzen PA, Williams LF. 1979. Acid alpha-naphthyl acetate esterase: presence of activity in bovine and human T and B lymphocytes. Immunology. 38(1):85–93.

40. Di Cesare S, Maloney S, Fernandes BF, Martins C, Marshall J, Antecka E, Odashiro AN, Dawson WW, Burnier MN. 2009. The effect of blue light exposure in an ocular melanoma animal model. J Exp Clin Cancer Res. 28(1): https://doi.org/10.1186/1756-9966-28-48

41. Hueso P, Rocha M. 1978. Comparative study of six methods for lymphocyte isolation from several mammalian sources and determination of their carbohydrate composition. Rev Esp Fisiol. 34(3):339-44.

42. Li X, Zhong Z, Liang S, Wang X, Zhong F. 2009. Effect of cryopreservation on IL-4, IFN? and IL-6 production of porcine peripheral blood lymphocytes. Cryobiology. 59(3):322-326. https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2009.09.004

43. Blaxhall PC. 1981. A comparison of methods used for the separation of fish lymphocytes. J Fish Biology. 18(2):177-181. https://doi.org/10.1111/j.1095-8649.1981.tb02812.x

44. Brandslund I, Rasmussen JM, Fisker D, Svehag S. 1982. Separation of human peripheral blood monocytes on continuous density gradients of polyvinylpyrrolidone-coated silica gel (Percoll®). Journal of Immunological Methods. 48(2):199-211. https://doi.org/10.1016/0022-1759(82)90194-6

45. Feucht H, Hadam M, Frank F, Riethmüller G. 1980. Efficient separation of human T lymphocytes from venous blood using PVP-coated colloidal silica particles (Percoll). Journal of Immunological Methods. 38(1-2):43-51. https://doi.org/10.1016/0022-1759(80)90329-4

46. Mizobe F, Martial E, Colby-Germinario S, Livett BG. 1982. An improved technique for the isolation of lymphocytes from small volumes of peripheral mouse blood. Journal of Immunological Methods. 48(3):269-279. https://doi.org/10.1016/0022-1759(82)90327-1

47. Sato J, Kawano Y, Takaue Y, Hirao A, Makimoto A, Okamoto Y, Abe T, Kuroda Y, Shimokawa T, Iwai A. 1995. Quantitative and qualitative comparative analysis of gradient‐separated hematopoietic cells from cord blood and chemotherapy‐mobilized peripheral blood. Stem Cells. 13(5):548-555. https://doi.org/10.1002/stem.5530130513

48. EU GMP Annex 1: Manufacture of Sterile Medicinal Products. [Internet].[updated 10 Jan 2008]. Available from: https://www.gmp-compliance.org/guidemgr/files/annex%2001[2008].pdf

49. <1043> ANCILLARY MATERIALS FOR CELL, GENE, AND TISSUE-ENGINEERED PRODUCTS. [Internet]. Available from: https://www.drugfuture.com/Pharmacopoeia/USP32/pub/data/v32270/usp32nf27s0_c1043

50. Leene W, Roholl PJM, Hoeben KA. 1982. Lymphocyte Differentiation in the Rabbit Thymus.319-325. https://doi.org/10.1007/978-1-4684-9066-4_44

51. BOYUM A, LOVHAUG D, TRESLAND L, NORDLIE EM. 1991. Separation of Leucocytes: Improved Cell Purity by Fine Adjustments of Gradient Medium Density and Osmolality. Scand J Immunol. 34(6):697-712. https://doi.org/10.1111/j.1365-3083.1991.tb01594.x

52. Archambault D, Morin G, Elazhary M. 1988. Isolation of bovine colostral lymphocytes: in vitro blastogenic responsiveness to concanavalin A and bovine rotavirus. Ann Rech Vet. 19(3):169-74.

53. Van Riper G, Siciliano S, Fischer PA, Meurer R, Springer MS, Rosen H. 1993. Characterization and species distribution of high affinity GTP-coupled receptors for human rantes and monocyte chemoattractant protein 1.. 177(3):851-856. https://doi.org/10.1084/jem.177.3.851

54. Chin S, Poey AC, Wong C, Chang S, Teh W, Mohr TJ, Cheong S. 2010. Cryopreserved mesenchymal stromal cell treatment is safe and feasible for severe dilated ischemic cardiomyopathy. Cytotherapy. 12(1):31-37. https://doi.org/10.3109/14653240903313966

55. Garayoa M, Garcia JL, Santamaria C, Garcia-Gomez A, Blanco JF, Pandiella A, Hernández JM, Sanchez-Guijo FM, del Cañizo M, Gutiérrez NC, et al. 2009. Mesenchymal stem cells from multiple myeloma patients display distinct genomic profile as compared with those from normal donors. Leukemia. 23(8):1515-1527. https://doi.org/10.1038/leu.2009.65

56. Grisendi G, Annerén C, Cafarelli L, Sternieri R, Veronesi E, Cervo GL, Luminari S, Maur M, Frassoldati A, Palazzi G, et al. 2010. GMP-manufactured density gradient media for optimized mesenchymal stromal/stem cell isolation and expansion. Cytotherapy. 12(4):466-477. https://doi.org/10.3109/14653241003649510

57. Brooke G, Rossetti T, Pelekanos R, Ilic N, Murray P, Hancock S, Antonenas V, Huang G, Gottlieb D, Bradstock K, et al. 2009. Manufacturing of human placenta-derived mesenchymal stem cells for clinical trials. 144(4):571-579. https://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2008.07492.x

58. Miltenyi S, Müller W, Weichel W, Radbruch A. 1990. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11(2):231-238. https://doi.org/10.1002/cyto.990110203

59. Mauldin JP, Nagelin MH, Wojcik AJ, Srinivasan S, Skaflen MD, Ayers CR, McNamara CA, Hedrick CC. 2008. Reduced Expression of ATP-Binding Cassette Transporter G1 Increases Cholesterol Accumulation in Macrophages of Patients With Type 2 Diabetes Mellitus. Circulation. 117(21):2785-2792. https://doi.org/10.1161/circulationaha.107.741314

60. Ali H, Jurga M, Kurgonaite K, Forraz N, McGuckin C. 2009. Defined serum-free culturing conditions for neural tissue engineering of human cord blood stem cells. Acta Neurobiol Exp (Wars). 69(1):12-23.

61. Figueroa-Tentori D, Querol S, Dodi IA, Madrigal A, Duggleby R. 2008. High purity and yield of natural Tregs from cord blood using a single step selection method. Journal of Immunological Methods. 339(2):228-235. https://doi.org/10.1016/j.jim.2008.09.019