Multipleksowa analiza miokin: Jednoczesny pomiar wielu czynników wydzielanych przez mięśnie
- Czym są miokiny?
- Analiza multipleksowa miokin
- Methods
- Wyniki multipleksu
- Podsumowanie
- Powiązane produkty
- References
Zróżnicowane systemy miokin są zaangażowane w różne szlaki sygnalizacyjne. Multipleksowe testy immunologiczne miokin, takie jak MILLIPLEX® Human Myokine Panel, umożliwiają badaczom jednoczesny pomiar wielu czynników wydzielanych przez mięśnie, zapewniając lepszy wgląd w powiązane choroby.
Czym są miokiny?
Mięśnie szkieletowe są aktywnie zaangażowane w syntezę i wydzielanie wielu białek określanych wspólnym mianem "miokin". 1 Miokiny mogą działać autokrynnie i/lub parakrynnie, regulując metabolizm mięśni szkieletowych, proliferację mięśni i różnicowanie mięśni (wzrost mięśni), jak pokazano na rysunku 1.
.
Rysunek 1. Miokiny, wydzielane przez mięśnie szkieletowe, wysyłają sygnały do różnych narządów, w tym wątroby, trzustki, kości i układu krążenia. Dokładne mechanizmy, za pomocą których angiogeneza jest regulowana, są nadal badane. Na podstawie Pedersen BK, Febbraio MA. Mięśnie, ćwiczenia i otyłość: mięśnie szkieletowe jako narząd wydzielniczy. Nat Rev Endocrinol. 2012 Apr 3; 8(8): 457 - 65. 1
Miokiny mogą również działać jako hormony endokrynologiczne, zmieniając metabolizm komórek, funkcję śródbłonka i wzrost/opóźnienie guza. Miokiny te są również zaangażowane w reakcje zapalne w wielu różnych tkankach, w tym w sercu, tkance tłuszczowej, piersi, okrężnicy, wątrobie, jelitach, śródbłonku, kościach i mięśniach szkieletowych. Pojawiające się dowody potwierdzają fakt, że w przeciwzapalnych, zwalczających choroby efektach ćwiczeń mogą pośredniczyć te miokiny, a szlaki sygnałowe miokin przecinają się z wrodzoną odpornością, sygnalizacją neurologiczną i odpowiedzią na insulinę.2,3
Dodatkowo, postępująca utrata funkcji i masy mięśni szkieletowych, sarkopenia, jest poważną cechą starzenia się i kluczowym składnikiem zespołów geriatrycznych, które obejmują spadek funkcjonalny i majaczenie. Coraz więcej dowodów sugeruje, że pochodzące z mięśni czynniki wzrostu i cytokiny, zwane miokinami, modulują postęp chorób związanych z wiekiem i przyczyniają się do komunikacji między tkankami, która leży u podstaw ogólnoustrojowego starzenia się.
Myokine Multiplex Analysis
Rosnące zapotrzebowanie na ilościowe oznaczanie miokin w przedklinicznych i translacyjnych modelach badawczych stworzyło zapotrzebowanie na multipleksowe testy immunologiczne w tych badaniach. Analiza multipleksowa miokin pozwala badaczom na jednoczesny pomiar wielu miokin. Na przykład MILLIPLEX® Human Myokine Panel to 15-pleksowy zestaw przeznaczony do jednoczesnego oznaczania ilościowego dowolnych lub wszystkich poniższych analitów w próbkach surowicy lub osocza, które pełnią wskazane funkcje biologiczne opisane w Tabeli 1.
Tabela 1. Anality w panelu ludzkich miokin MILLIPLEX® i ich funkcje biologiczne.
Metody
Testy multipleksowe z wykorzystaniem standardów zawartych w zestawie testowym, a także próbek surowicy i osocza, przeprowadzono przy użyciu MILLIPLEX® Human Myokine Magnetic Bead Panel, zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym protokole. Kulki pokryte przeciwciałem wychwytującym inkubowano z próbkami w celu unieruchomienia analitu. Dodano biotynylowane przeciwciało wykrywające. To przeciwciało wykrywające wiąże się z analitem, tworząc kanapkę. Dodano barwnik streptawidyna-fykoerytryna (SA-PE), aby mógł wiązać się z kanapką i emitować światło fluorescencyjne.
Wyniki multipleksu
Używając wzorców dla każdego analitu seryjnie rozcieńczonego w matrycy surowicy, przygotowano krzywe standardowe w celu określenia odpowiedzi testu (mierzonej w średniej intensywności fluorescencji [MFI] w odniesieniu do stężenia analitu). Krzywe standardowe wykazały, że test wygenerował liniową odpowiedź MFI w zakresie od 3 do 5 rzędów wielkości dla wszystkich analitów (Rysunek 2).
Rysunek 2. Używając wzorców dla każdego analitu seryjnie rozcieńczonego w zwalidowanej matrycy surowicy, przygotowano krzywe standardowe w celu określenia odpowiedzi testu w odniesieniu do stężenia analitu. Krzywe standardowe ustaliły liniowość testu w zakresie od trzech do czterech rzędów wielkości dla wszystkich analitów. Stężenia analitu mierzono w MFI.
Reaktywność krzyżowa
Nie zaobserwowano znaczącej reaktywności krzyżowej w obrębie panelu. Większość przeciwciał w tym panelu ludzkich miokin może rozpoznawać próbki małp, z wyjątkiem fraktalkiny, LIF i IL-6. Stwierdzono następującą reaktywność krzyżową:
- Apelina reaguje krzyżowo z myszą, psem, królikiem i świnką miniaturową.
- BDNF reaguje krzyżowo z myszą i królikiem.
- EPO reaguje krzyżowo z psem i królikiem.
- IL-15 reaguje krzyżowo z koniem.
- Miostatyna reaguje krzyżowo z psem, świnką miniaturową i koniem.
- FABP3 reaguje krzyżowo ze szczurem, królikiem, świnką miniaturową i koniem.
- FSTL1 reaguje krzyżowo z myszą, królikiem, świnką miniaturową i koniem.
- OSM reaguje krzyżowo z psem i świnką miniaturową.
- FGF-21 reaguje krzyżowo z psem, świnką miniaturową i koniem.
Należy pamiętać, że w tym badaniu przetestowano tylko ograniczoną liczbę normalnych próbek i nie mogliśmy wykluczyć możliwej reaktywności krzyżowej w innych normalnych lub chorobowych próbkach.
Odzysk procentowy
Znane ilości każdego analitu (punkty 3, 4, 5 na krzywych wzorcowych) wprowadzono do normalnych próbek ludzkiej surowicy/osocza. Procent odzysku został obliczony przy użyciu następującego równania:
Obliczone stężenie analitu / oczekiwane stężenie *100
Odzysk wszystkich domieszkowanych próbek wynosił od 70% do 130%.
Spójność i dokładność z innymi panelami multipleksowymi
Aby sprawdzić spójność i dokładność między testami MILLIPLEX®, porównaliśmy kwantyfikację analitów występujących zarówno w tym panelu ludzkiej miokiny, jak i w innych panelach MILLIPLEX®. Wszystkie krzywe standardowe wykazywały nakładającą się odpowiedź, a stężenia analitów obliczone w próbkach biologicznych korelowały bardzo dobrze.
Na przykład wartości próbek FGF-21 i FABP3 mierzono zarówno przy użyciu panelu MILLIPLEX® Human Myokine, jak i paneli MILLIPLEX® Human Liver Protein i Human CVD1. Krzywe standardowe zostały utworzone przy użyciu standardów oczyszczonego FGF-21. FABP3 z dwóch paneli wykazał nakładającą się odpowiedź testu i zakres liniowy testów. Korelacja testu była doskonała, z nachyleniem i wartością R zbliżającą się do jedności (Rysunek 3).
Rysunek 3. Porównanie MILLIPLEX® Human Myokine Panel z MILLIPLEX® Liver Panel i MILLIPLEX®CVD Panel do pomiaru odpowiednio FGF-21 (góra) i FABP3 (dół).
Oprócz FGF-21 i FABP3, porównaliśmy te same anality w tym panelu ludzkich miokin z innymi panelami MILLIPLEX®. Wszystkie krzywe standardowe wykazały nakładające się odpowiedzi i stężenia analitów, które bardzo dobrze korelowały z próbkami biologicznymi (dane nie pokazane).
Próbki normalne vs. próbki z sepsą
Wreszcie, biologiczną kwalifikację panelu testowego przeprowadzono przy użyciu próbek surowicy/osocza od zdrowych osób i od osób z sepsą. Zgodnie z oczekiwaniami, w teście oznaczono ilościowo jednocześnie 15 nowych miokin. FABP3, Irisin, FSTL1, OSM, IL-6, FGF-21 i Musclin były znacząco podwyższone w próbkach sepsy (Tabela 2).
Podsumowanie danych próbki normalnej [pg/mL]
Podsumowanie danych próbki sepsy [pg/mL]
Tabela 2. Porównanie biomarkerów wyrażonych w normalnych i septycznych próbkach surowicy/osocza. Wykazano, że FABP3, Irisin, FSTL1, OSM, IL-6, FGF-21 i Musclin były regulowane w górę w próbkach sepsy. *Nie badano.
Podsumowanie
Panel MILLIPLEX® Human Myokine Panel jest czuły, dokładny i powtarzalny. Wartości próbek wygenerowane za pomocą tego nowego panelu są zgodne z poprzednimi panelami, które zawierają niektóre z tych samych analitów. Panel ten zapewnia idealny test immunologiczny dla różnych obszarów badawczych, w tym chorób metabolicznych, nerwowo-mięśniowych i idiopatycznych miopatii.
Tylko do użytku badawczego. Nie do użytku w procedurach diagnostycznych.
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?