간접 ELISA
시약 및 장비
- 인산 완충 식염 정제수(PBS) 정제: 10 mM 인산 완충액, pH 7.4, 150 mM NaCl(제품 번호 P4417) 및 0.1 % 아지드화 나트륨(제품 번호 S2002).
- 탄산-중탄산 완충액 캡슐, pH 9.6(제품 번호 C3041).
- 세척 완충액(PBS-T): 10 mM 인산 완충액 pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05 % Tween 20(제품 번호 P3563).
- 단클론 1차 항체.
- 항체 대조군: 종 및 동형 일치, 비특이 면역 글로불린(예: 생쥐 단클론 1차 항체의 대조군으로서 생쥐 골수종 단백질)
- 알칼리 인산 분해 효소 접합 2차 항체 또는 페록시 다아제 접합 2차 항체
- 알칼리 인산 분해 효소 접합 2차 항체의 기질(예: SIGMAFAST™ pNPP 정제, 제품 번호 N1891) 또는 페록시다아제 접합 2차 항체의 기질(예: SIGMAFAST™ OPD 정제, 제품 번호 P9187).
- 알칼리 인산 분해 효소용 정지 시약: 3 M NaOH(옵션) 또는 페록시다아제용 정지 시약: 3 M HCl 또는 3 M H2SO4(옵션).
- Microtiter 플레이트
- 405 nm 또는 450/492 nm 필터(각각 pNPP 또는 OPD용)가 장착된 Microtiter 플레이트 판독기.
절차
- 탄산-중탄산 완충액 또는 PBS에서 적당한 농도로 항원 용액을 준비합니다.
- Microtiter 플레이트의 각 웰에 위의 용액 0.2 ml를 피펫팅합니다.
- 37 °C에서 30분 동안 또는 4 °C에서 밤새 배양(덮개를 덮은 채)합니다.
- 코팅 용액을 제거합니다. PBS-T로 3회 세척합니다.
참고: 비특이 결합 문제가 발생하는 경우 추가 차단 단계(30분 5 % BSA-PBS)가 필요할 수 있습니다. 자세한 정보는 다음을 참조하십시오. Vogt, R.F., et al., J. Immunol. Meth., 101, 43 (1987).
- PBS-T에서 단클론 1차 항체를 희석합니다. 최적의 희석도는 Titration 분석법을 사용하여 결정해야 합니다.
- 각 웰에 희석된 단클론 항체 0.2 ml를 첨가합니다. 음성 대조군은 PBS-T에서 희석한 종 및 동형 일치 비특이 면역 글로불린이어야 합니다.
- 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
- 항원 코팅 4단계에서처럼 세척합니다.
- 효소 접합 2차 항체를 PBS-T에 희석합니다. 각 웰에 이 용액 0.2 ml를 첨가합니다. 최적의 희석도는 Titration 분석법을 사용하여 결정해야 합니다.
- 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
- 항원 코팅 4단계에서처럼 세척합니다.
- 마지막 배양 도중 및 사용 직전에 효소 기질을 준비하거나 미리 만든 액체 기질을 실온에 둡니다.
- 방금 준비한 기질 0.2 ml를 각 웰에 첨가합니다.
- 30분 후 양성 웰에서 색상이 변해야 합니다(pNPP는 노란색, OPD는 주황색).
- 흡수도를 마이크로플레이트에서 직접 판독하거나(pNPP는 405 nm, OPD는 450 nm에서) 적절한 정지 시약의 웰당 50 µL로 반응을 정지하고 나중에 흡수도를 판독할 수 있습니다(pNPP는 405 nm, OPD는 492 nm에서).
포획 ELISA
포획 ELISA(“샌드위치” ELISA라고도 함)는 피코그램부터 마이크로그램까지 기질(예: 호르몬, 세포 신호전달 화학물질, 전염병 항원 및 시토카인)의 양을 측정하기 위한 민감한 분석법입니다. 몇 가지 이유로 직접 또는 간접 ELISA보다 이런 종류의 ELISA 설계가 필요할 수 있습니다. 분석할 기질이 폴리스티렌 Microtiter 플레이트(예: 세포 배양 상충액의 단백질)와 결합하기에는 지나치게 묽거나 플라스틱(예: 작은 유기 분자)에 잘 결합되지 않을 수 있습니다. 너무 많은 다른 물질과 혼합되어 웰이 플레이트에 결합될 수 있습니다. 포획 ELISA를 설명하거나 활용하는 2가지 Sigma 키트는 TNF-alpha 키트와 Mouse Isotyping Reagents 키트(제품 번호 ISO2)입니다.
시약 및 장비
- 인산 완충 생리 식염수(PBS): 10 mM 인산 완충액, pH 7.4, 150 mM NaCl 정제(제품 번호 P4417) 및 0.1 % 아지드화 나트륨(제품 번호 S2002)
- 탄산-중탄산 완충액 캡슐, pH 9.6(제품 번호 C3041)
- 세척 완충액(PBS-T): 10 mM 인산 완충액 pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05 % Tween 20(제품 번호 P3563)
- 포획 또는 코팅 항체
- 표준 곡선에 사용할 대조 항원
- 표지 검출 항체
- 기질. 일반적으로 가장 민감한 기질이 사용됩니다(페록시다아제를 효소 표지로 사용하는 경우 TMB 또는 OPD).
- 정지 용액(옵션)
- Microtiter 플레이트
- Microtiter 플레이트 판독기
절차
참고: 이는 일반적 프로토콜로 제공됩니다. 포획 항체, 시료, 대조군의 최적 희석도와 배양 시간은 경험적으로 결정되어야 하며, 광범위한 Titration이 필요할 수 있습니다. 원칙적으로는 이 절차에 설명된 대로 효소 표지 검출 항체를 사용합니다. 하지만 검출 항체가 표지되지 않은 경우 2차 항체는 코팅 항체 또는 시료와 교차 반응할 수 없습니다. 적절한 음성 및 양성 대조군도 포함되어야 합니다.
- 탄산-중탄산 완충액 또는 PBS에서 포획 또는 코팅 항체를 적절히 희석합니다. 포획 항체는 일반적으로 0.2-10 µg/ml로 플레이팅합니다. 정제된 친화력 항체를 사용하거나 최소한 IgG 분획물을 사용하는 것이 바람직합니다.
- Microtiter 플레이트의 각 웰에 희석된 포획 항체 0.2 ml를 피펫팅합니다.
- 37 °C에서 1시간 동안 플레이트를 배양(덮개를 덮은 채)합니다.
- 코팅 용액을 제거합니다. 세척 완충액(PBS-T)으로 플레이트를 3회 세척합니다.
- 적절히 희석된 시료와 대조군 0.2 ml를 적절한 웰에 첨가합니다. 일반적으로 시료는 10 ng-10 µg/웰 범위의 PBS에서 희석됩니다(분석법이 민감할수록 더 적은 시료가 필요합니다).
- 실온에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다.
- 시료 또는 대조군 용액을 제거합니다. 세척 완충액(PBS-T)으로 플레이트를 3회 세척합니다.
- 효소 표지 검출 항체를 희석합니다.
- 각 웰에 적절히 희석된 검출 항체 0.2 ml를 피펫팅합니다.
- 실온에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다.
- 검출 항체 용액을 제거합니다. 세척 완충액(PBS-T)으로 플레이트를 3회 세척합니다.
- 적절한 기질 용액을 첨가합니다.
- 플레이트가 발색되도록 하고(일반적으로 30분) 정지 용액을 첨가합니다(옵션).
- 마이크로플레이트 판독기에서 적절한 파장으로 흡수도를 판독합니다.
재료
Loading
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Harlow E, Lane D. 1988. Antibodies: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Larboratory Press.
2.
Hornbeck P. 1992. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Current Protocols in Immunology. 1(1):2.1.1-2.1.22. https://doi.org/10.1002/0471142735.im0201s01
3.
4.
5.
1996. Immunoassay. Elsevier.
6.
7.
Tijssem P. 1985. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Practice and Theory of Enzyme Immunoassays. 15. Elsevier B.V.
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