ELISA 프로토콜

• 샌드위치 분석법
• 인산화 분석법
• EIA 분석법
• 세포 기반 분석법

샌드위치 분석법

1. 사용 이전에 모든 시약 및 시료가 실온(18-25 °C)이 되도록 하십시오. 모든 표준 물질과 시료에 대해 최소한 두 번 반복 수행할 것을 권장합니다.
2. 각 표준 물질 및 시료 100 µL를 전용 웰에 추가합니다. 웰을 덮개로 덮고 실온에서 2시간 30분 동안 배양하거나 약하게 흔들면서 4 °C에서 밤새 배양합니다.
3. 용액을 폐기하고 1X 세척 용액을 사용하여 4번 세척합니다. 멀티채널 피펫이나 자동 세척기를 사용하여 워시 버퍼(300 µL)로 모든 웰을 가득 채우는 방식으로 세척하십시오. 양호한 성능을 얻으려면 각 단계에서 용액을 완전히 제거하는 것이 가장 중요합니다. 마지막 세척 이후 남은 모든 워시 버퍼를 흡입기를 사용하거나 다른 용기에 옮겨 부어 제거합니다. 플레이트를 뒤집고 깨끗한 종이 수건으로 닦아냅니다.
4. 같은 배율로 조제된 검출용 항체 100 µL를 각 웰에 추가합니다. 웰을 덮개로 덮고 실온에서 1시간 동안 약하게 흔들면서 배양합니다.
5. 용액을 폐기합니다. 3단계와 동일하게 세척 절차를 반복합니다.
6. 준비된 스트렙타아비딘 용액 100 µL를 각 웰에 추가합니다. 웰을 덮개로 덮고 실온에서 45분 동안 약하게 흔들면서 배양합니다.
7. 용액을 폐기합니다. 3단계와 동일하게 세척을 반복합니다.
8. TMB 원스텝 기질 시약(품목 H) 100 µL를 각 웰에 추가합니다. 웰을 덮개로 덮고 실온에서 빛을 차단한 상태로 30분 동안 약하게 흔들면서 배양합니다.
9. 반응 정지액(항목 I) 50 µL를 각 웰에 추가합니다. 450 nm의 흡광도에서 즉시 판독합니다.

인산화 분석법

1. 사용 이전에 모든 시약이 실온(18-25 °C)이 되도록 하십시오. 모든 시료 또는 양성 대조에 대해 최소한 두 번 반복 수행할 것을 권장합니다.
2. 100 µL의 각 시료 또는 양성 대조를 전용 웰에 추가합니다. 플레이트 홀더로 웰을 덮고 실온에서 2시간 30분 동안 배양하거나 4 °C에서 밤새 흔들어 배양합니다.
3. 용액을 폐기하고 1X 세척 용액을 사용하여 4번 세척합니다. 멀티채널 피펫이나 자동 세척기를 사용하여 워시 버퍼(300 µL)로 모든 웰을 가득 채우는 방식으로 세척하십시오. 양호한 성능을 얻으려면 각 단계에서 용액을 완전히 제거하는 것이 가장 중요합니다. 마지막 세척 이후 남은 모든 워시 버퍼를 흡입기로 제거합니다. 플레이트를 뒤집고 깨끗한 종이 수건으로 닦아냅니다.
4. 준비된 1X 비오티닐레이트 항 포스포타이로신 항체 100 µL를 각 웰에 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 흔들어 배양합니다.
5. 용액을 폐기합니다. 3단계와 동일하게 세척을 반복합니다.
6. 준비된 1X HRP-스트렙타아비딘 용액 100 µL를 각 웰에 추가합니다(시약 제조 6단계 참조). 실온에서 45분 동안 흔들어 배양합니다.
7. 용액을 폐기합니다. 3단계와 동일하게 세척을 반복합니다.
8. TMB 원스텝 기질 시약(품목 H) 100 µL를 각 웰에 추가합니다. 실온에서 빛을 차단한 상태로 30분 동안 흔들어 배양합니다.
9. 반응 정지액(항목 I) 50 µL를 각 웰에 추가합니다. 450 nm에서 즉시 판독합니다.

EIA 분석법

1. 시약 제조 단계에서는 키트 시약을 얼음 위에 보관하십시오. 모든 표준 물질과 시료에 대해 최소한 두 번 반복 수행할 것을 권장합니다.
2. 항 “표적” 항체 100 µL를 각 웰에 추가합니다. 실온에서 1.5시간 동안 약하게 흔들어(초당 1-2바퀴) 배양합니다. 또한 4 °C에서 밤새 배양할 수도 있습니다.
3. 용액을 폐기하고 멀티채널 피펫이나 자동 플레이트 세척기를 사용하여 1X 세척 용액(각 200-300 μl)으로 4번 세척합니다. 양호한 분석 결과를 얻으려면 각 단계에서 용액을 완전히 제거하는 것이 가장 중요합니다. 마지막 세척 이후 남은 모든 워시 버퍼를 흡입기를 사용하거나 다른 용기에 옮겨 부어 제거합니다. 플레이트를 뒤집고 깨끗한 종이 수건으로 닦아냅니다.
4. 각 표준 물질, 양성 대조 및 시료 100 µL를 전용 웰에 추가합니다. 웰 하나는 빈 것으로 남겨둡니다(분석 희석용). 웰을 덮개로 덮고 실온에서 2.5시간 동안 약하게 흔들어(초당 1-2바퀴) 배양하거나 4 °C에서 밤새 배양합니다.
5. 용액을 폐기하고 3단계에서 설명한 대로 4번 세척합니다.
6. 준비된 HRP-스트렙타아비딘 용액 100 µL를 각 웰에 추가합니다. 실온에서 45분 동안 약하게 흔들어 배양합니다. 배양 시간은 정확하게 45분을 지킬 것을 권장합니다.
7. 용액을 폐기하고 3단계에서 설명한 대로 4번 세척합니다.
8. TMB 원스텝 기질 시약(품목 H) 100 µL를 각 웰에 추가합니다. 실온에서 빛을 차단한 상태로 30분 동안 약하게 흔들어주면서(초당 1-2번) 배양합니다.
9. 반응 정지액(항목 I) 50 µL를 각 웰에 추가합니다. 450 nm의 흡광도에서 즉시 판독합니다.

세포 기반 분석법

참고:모든 배양 및 세척 단계는 약하게 흔들거나 회전하는 조건으로 실시해야 합니다(초당 1-2바퀴).

1. 아래와 같이 실험 방법을 설계합니다.
   옵션: HUVECs, HMEC‐1 또는 기타 느슨하게 부착된 세포를 살포하는 경우 100 μL의 폴리라이신(Sigma-Aldrich Product No. P4832 권장)을 각 웰에 첨가하는 방식으로 Uncoated 96‐Well 마이크로 플레이트(ITEM A)를 코팅한 다음 제조사의 설명서를 따릅니다. 프리코트 CellBIND^® 마이크로 플레이트 또는 기타 폴리라이신 처리된 조직 배양 플레이트를 ITEM A 대신에 사용할 수 있습니다.
2. 준비된 Uncoated 96‐Well 마이크로 플레이트(ITEM A)의 각 웰에 10,000-30,000개 세포에 해당하는 100 μL를 파종하고 37 °C에서 5 % CO₂로 밤새 배양합니다.
   참고: 사용된 최적의 세포 수는 세포 라인 및 단백질 인산화물의 상대적인 양에 따라 다릅니다. 세포 수를 초과하여 또는 부족하게 사용할 수 있으나 이는 경험적으로 결정해야 합니다. 참고: 억제제 또는 활성제로 처리하기 전에 셀 라인에 따라 4-24시간까지 세포를 굶주리게 할 수 있습니다.         
3. 제조사의 지침에 따라 다양한 치료제, 억제제(예: siRNA 또는 화학제 등) 또는 활성제를 적용하고 원하는 시간만큼 배양합니다. 
   참고: 제조사의 설명서에 달리 명시하지 않은 한 세포를 처리하기 전에 혈청이 포함되지 않은 세포 배양 배지에 억제제 또는 활성제를 용해하는 것이 좋습니다.       
4. 마이크로 플레이트를 뒤집어 세포 배양 배지를 버리고 개수대 위에서 마이크로 플레이트 바닥면을 가볍게 두드립니다.
5. 준비된 1X 워시 버퍼 A(ITEM B) 200 µL를 각 웰에 피펫팅하여 세척합니다. 워시 버퍼를 버리고(4단계와 동일) 매번 새로운 워시 버퍼로 두 번 더 세척하여 총 3회 세척합니다. 마지막 세척 이후 종이 타월로 마이크로 플레이트를 부드럽게 닦아 여분의/남겨진 버퍼를 제거합니다.
   참고: 세포 손실을 막기 위해서는 세포에 직접 피펫팅하지 마십시오. 대신에 세포 배양 웰의 벽을 따라 용액을 조금씩 분배합니다. 또한 용액을 버릴 때 진공 흡입기를 사용하거나 마이크로 플레이트를 너무 세게 두드리지 마십시오.       
6. 정착액(ITEM D) 100 µL를 각 웰에 추가하고 실온에서 20분 동안 배양합니다.
   참고: 정착액은 세포에 침투하는데 사용됩니다.  
7. 5단계와 동일하게 세척을 반복합니다.
8. 준비된 1X 퀜칭 버퍼(ITEM E) 200 µL를 각 웰에 추가하고 실온에서 20분 동안 배양합니다.
   참고: 퀜칭 버퍼는 백그라운드 반응을 최소화하는 데 사용됩니다.  
9. 1X 워시 버퍼 A를 사용하여 4번 세척합니다.
10. 준비된 1X 블로킹 버퍼(ITEM F) 200 µL를 각 웰에 추가하고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 
    
11. 준비된 1X 워시 버퍼 B(ITEM C)를 사용하여 3번 세척합니다.
    참고: 필요한 경우 세척 이후 마이크로 플레이트를 80 °C에서 보관할 수 있습니다.
12. 준비된 1X 1차 항체(ITEM G‐1, G‐2, G‐3, H‐ 1, H‐2 또는 H‐3) 50 µL를 각 해당 웰에 추가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
13. 1X 워시 버퍼 B를 사용하여 4번 세척합니다.
14. 준비된 HRP 결합형 2차 항체(ITEM I‐2) 50 µL를 각 웰에 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
15. 13단계를 반복합니다.
16. TMB 기질 100 μL를 각 웰에 추가하고 실온에서 빛을 차단한 상태로 30분 동안 배양합니다.
17. 반응 정지액(ITEM K) 50 µL를 각 웰에 추가합니다. 450 nm에서 즉시 판독합니다.

이 프로토콜은 지침으로만 사용됩니다. 자세한 지침은 각 키트에 대한 세부 기술 공고를 참조하십시오.