Duolink^™ PLA アプリケーション

Duolink^™  PLAを用いると、従来の免疫蛍光染色（IF）や免疫組織染色（IHC）のようであるものの、はるかに感度の高いシグナルが得られる簡単に実施できる免疫検出手法で、タンパク質間相互作用や翻訳後修飾、低発現タンパク質などを検出や定量、可視化が可能です。Duolink^™  PLA製品は、以下のさまざまなアプリケーションで多用途にご利用いただけます。

タンパク質間相互作用
翻訳後修飾
低濃度タンパク質
タンパク質の局在
デジタルによる定量

タンパク質間相互作用

多くの重要な生物学的プロセスは、DNA複製や転写、翻訳、スプライシング、分泌、細胞周期調節、シグナル伝達、および中間代謝を含む、タンパク質間相互作用のあるタンパク質複合体によって決定されます。タンパク質の役割と活性は、他のタンパク質との相互作用によってしばしば変化します。タンパク質が細胞のさまざまな構成要素とどのように相互作用するかに関する研究は、疾患の経路を理解するという基本的な関心によって推進されています。タンパク質間相互作用が一過性であるか安定であるかにかかわらず、変化を測定することが重要です。Duolink^™  を使用することで、安定した、弱い、一過性の内在性タンパク質相互作用を可視化できます。

タンパク質が何と相互作用するかを確認するには、 STRINGデータベース をご覧ください。

翻訳後修飾

タンパク質の相互作用は、一方または両方のタンパク質の修飾状態に依存することがよくあります。翻訳後修飾（PTM）とは、リボソームによる翻訳が完了した後のタンパク質合成中のタンパク質の共有結合および一般的に酵素による修飾を指します。機能的および構造的プロテオミクス研究を調節するPTMには、リン酸化、グリコシル化、アシル化、硫酸化、ユビキチン化などがあります。これまではPTMの分析には、ゲル電気泳動、質量分析、HPLC、免疫染色などの複数の技術が必要でした。Duolink^™ を使用することで、固定した細胞や組織内の内在性修飾イベントを可視化できます。

翻訳後修飾の詳細については、 こちらをご覧ください。

低濃度タンパク質

タンパク質を本来の状態で研究することは、真の疾患生物学研究にとって重要です。ただし、特定のサンプル内のタンパク質濃度は、ダイナミックレンジが広い場合があります。これまでタンパク質を本来の状態で研究するために、目的のタンパク質を過剰発現させたり、タグ付けしたり、遺伝子組み換えしたりする必要がありました。Duolink を使用することで、単一の タンパク質またはタンパク質間相互作用の内在性タンパク質のレベルを検出できます。

タンパク質の局在

タンパク質の局在化では、タンパク質が細胞内のどこに存在するかを計算的に予測することもあります。細胞内レベルでのタンパク質の局在を理解することは、タンパク質の機能、それらがどのように相互作用するか、および細胞のシグナル伝達経路をよりよく理解することにつながります。従来の技術では、内在性タンパク質の局在化の研究が可能ですが、他のタンパク質とのオフターゲット結合や交差反応性を示すこともよくあります。Duolink^™ は、二次抗体と同様の仕組みで、目的のタンパク質の特異性と感度を高めることができます。

デジタルによる定量

細胞画像と組織画像の両方をデジタルで分析できます。PLAデータの分析では、ほとんどの顕微鏡用のソフトウェアとフリーソフトウェア（BlobFinder、Image J、Cell Profilerなど）を使用できます。ソフトウェアを用いることで、核の自動検出や細胞質サイズの推定などの機能により、組織または細胞集団の発現レベルのシングルセルでの統計分析が可能になります。

フローサイトメトリー

フローサイトメトリーは、細胞集団の分析に最適な方法です。Duolink^™ flowPLA検出キットは、タンパク質、タンパク質間相互作用、およびタンパク質修飾を高感度で検出することで、より優れた細胞集団分析を可能にします。Duolink^™ flowPLAを用いた実験には、固定済の浮遊細胞、目的のタンパク質を特異的に認識する2つの一次抗体、PLAプローブのペア（1つはPLUS、1つはMINUS）、洗浄バッファー、およびDuolink^™ flowPLA検出キットが必要です。flowPLAキットは、以下の4種類の蛍光色素で利用できます：赤、緑、オレンジ、遠赤。

Duolink^™ PLA の増幅時間を長くすることで、フローサイトメトリーによる低濃度のタンパク質ターゲットの検出を補助することが可能です。EZH2によって媒介されたHistone H3上のリジン27のトリメチル化（H3K27me3）を検出するためにDuolink^™PLAを実施した。A) 100分間の増幅後、DU145細胞の核（青）内にわずかなPLAシグナル（赤）が蛍光顕微鏡で検出された。FITC-Phalloidinで染色したアクチン（緑）をカウンターステインとして使用した。B) 増幅時間を長くすることで、従来のフローサイトメトリーによるEZH2-H3K27me3相互作用のような低濃度タンパク質イベントの検出が促進された。C) Duolink^™PLAとイメージングフローサイトメトリーとの組み合わせにより、大きな細胞集団におけるタンパク質またはタンパク質イベント（相互作用または修飾）の局在を特定できる。

参考文献

1. Phizicky E, Fields S. 1995. Protein-protein interactions: Methods for detection and analysis. Microbiol Rev..(59):94-123.

2. Stadler C, Rexhepaj E, Singan VR, Murphy RF, Pepperkok R, Uhlén M, Simpson JC, Lundberg E. 2013. Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation for protein localization in mammalian cells. Nat Methods. 10(4):315-323. https://doi.org/10.1038/nmeth.2377