MISSION® siRNA よくあるお問い合わせ(FAQ)
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一般事項
Duplexデザイン
実験と分析
in vivoアプリケーションとN-TER™(販売中止)の使用
バリデーションと保証
一般事項
siRNAとは?
siRNA(低分子干渉RNA)は、mRNAを切断するためにRISC(RNA誘導型サイレンシング複合体)を誘導することによって遺伝子発現をサイレンシングする短鎖の二本鎖RNAです。
siRNAの平均分子量は?
一般的な21mer duplexの場合、約13,300です。実際の分子量の一覧は、標準分析証明書/テクニカルデータシートに記載されています。
siRNAの推奨保管条件は?
短期保管の場合、一本鎖RNAオリゴヌクレオチドはTEバッファー中で-80℃で保存してください。長期保管の場合は、-80℃でエタノール沈殿物として保管するのが最適です。RNaseへのばく露を最小限に抑える予防策を講じることで、有効期間が長くなります。
-80℃の冷凍庫を使用できない場合は、-20℃での保管でほとんど問題ありません。再懸濁した場合は、小分けにして保管してください。凍結と解凍の繰り返しや、「霜取り機能付き」冷凍庫での保管は推奨されません。
siRNAの安定期間は?
メルクのR&Dチームは、複数のsiRNA duplexで安定性試験を実施しました。-20℃で3年間保管した乾燥状態のsiRNA duplexは安定性を示しました。室温で保管した乾燥状態のsiRNA duplexは、2年後にごくわずかな分解の兆候のみを示しました。いくつかの配列特異的な安定性差異の試験を実施しましたが、2年目の時点で分解の兆候を示したのは一部の配列のみでした。これを示したのは二本鎖siRNAのみです。
再構成siRNAは何回凍結・解凍ができますか?
凍結と解凍の繰り返しや、「霜取り機能付き」冷凍庫での保管は推奨されません。siRNAは、-20℃で最大6カ月保存できます。霜取り機能のない冷凍庫の場合、溶液の凍結と解凍は3~5回以内を推奨しています。凍結乾燥の形態では、-20℃の場合よりも長期間duplexが安定します。
siRNAに適用する必要のある精製のレベルは?
脱塩を行えば、ほとんどのニーズに十分応えられます。分離鎖の二重化は、自己相補鎖間の完全な一致に依存するため、このプロセスが全長オリゴヌクレオチドに対して自己選択されます。
製造拠点によっては、さらに全体的な完全性を確認するために、duplex自体が未変性のPAGEゲル上で個別に実行されることがあります。
単鎖RNAをアニーリングしてduplexを形成する方法は?
バリデーション済みのTuschlプロトコルを用います。アニーリングでは、20 μM一本鎖21塩基RNAをアニーリングバッファー(100 mM酢酸カリウム、pH 7.4の30 mM HEPES-KOH、2 mM酢酸マグネシウム)中において90℃で1分間、その後37℃で1時間インキュベーションします。高濃度のsiRNAが必要な場合は、20 μMを超えるRNAをそれぞれ使用します。
溶液中のsiRNAの計算量が標準分析証明書/テクニカルデータシートの量と異なるのはなぜですか
可能性のある理由は複数あります:
- サンプルが均質でない可能性があります。
- 装置の違いにより、見かけ上の値に差が生じた可能性があります。デュアルビームUV-Vis分光光度計を推奨しています。
- サンプルの濃度が高すぎる可能性があります。吸光度値は、0.15~0.6の範囲の標準曲線の線形領域内が最も高精度です。
- サンプルを希釈しすぎた可能性があります。少量(1~1.5 μL)の希釈液による測定は、ばらつきによる影響を大きく受けます。
2週間前にsiRNAを受け取り、実験台に置いたままになっていても問題ありませんか?
はい。サンプルは乾燥状態で発送され、室温で2~4週間は安定的です。siRNAを受け取ったら-20℃(ただし、-80℃が望ましい)で保管するよう推奨しています。
5'または3’タグの付いたsiRNAの作成は可能ですか?
はい。複数の5'または3’修飾に対応可能なカスタムsiRNAを提供しています。
修飾塩基を有するsiRNAの作成は可能ですか?
はい。複数の対応が可能なカスタムsiRNAを提供しています。
修飾塩基および5'または3’タグの機能について説明してください。
一般的な選択肢を以下に示します:
- アミノ修飾因子C6、アミノ修飾因子C7:これらの修飾は、単鎖RNAの一方または両方の末端をブロックするためか(センス鎖の5’末端でアミンを用いるとRISCへのアンチセンス鎖の好ましいローディングが促進されます)、またはNHSエステル色素を付着するためのいずれかに使用されます。NHSエステル色素は、ホスホロアミダイトとして使用できない可能性があるか(合成中にいずれかの単鎖RNAに直接添加)、またはRNAの切断と脱保護の化学反応におそらく適合しません。
- ビオチン:一般に、ストレプトアビジンでタグ付けされた分子を付着するため、またはsiRNAを他の分子から分離するために使用されます。
- Thiol-Modifier C6 S-S:アミンと同じように、ジスルフィド結合によって他の分子を付着するために使用できます。
- Cyanine 3、5、および5.5:蛍光法によっていずれかの単鎖RNAを検出するために使用されます。これは、トランスフェクション効率の可視化や測定に役立ちます。
- 6-FAM™:蛍光法によっていずれかの単鎖RNAを検出するために使用されます。これは、トランスフェクション効率の可視化や測定に役立ちます。
- リン酸:アミン修飾と同じように、鎖選択プロセスに役立つ可能性があります。
- 2'-OMe RNA:細胞ヌクレアーゼ分解に耐性を示し、特異性を強化します。
- ホスホロチオエート:細胞ヌクレアーゼ分解に耐性を示します。
- コレステロール:原形質膜の透過性を改善します。
上記オプションに関する詳細については、修飾のページをご覧ください。
siRNAのデザインはできますか?
はい。カスタムsiRNAとして注文できます。
GMP siRNAを提供していますか?
いいえ。
Duplexデザイン
プレデザインsiRNAにはどのオーバーハングを使用していますか?また、その選択理由は?
dTdTオーバーハングを使用しています。*Elbashirほか 2001によれば、「細胞培養培地中およびトランスフェクト細胞内のsiRNAのヌクレアーゼ耐性を強化できるため、チミジンオーバーハングが選択されました。」
RNAi研究の初期の頃に、この分野のリーダーがdTdTオーバーハングを選択したため、これはある意味では歴史上重要な選択です。siRNA設計にはdTdTオーバーハングがよく使用されますが、UUまたはUGオーバーハングも一般的です。2001年以降のElbashirらの複数の論文には、遺伝子数と系統数の制限に基づいたsiRNA設計のための一連の規則が記載されていますが、研究者はdTdTおよびUUオーバーハングの使用を続けています。
*Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K & Tuschl T (2001).Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in mammalian cell culture.Nature, 411, 494-498.
Rosettaアルゴリズムのしくみは?
Rosetta siRNA設計アルゴリズムは、位置特異的スコアメトリクス(PSSM)と極めて重要なsiRNAシードリージョンの知識を使用して、目的のターゲット遺伝子に対して最も効果的で特異的なsiRNAシーケンスを予測します。さらに、Rosetta siRNA設計アルゴリズムは3年を超える遺伝子サイレンシング実験のフィードバックによって鍛えられてきたため、アルゴリズムのin-silico規則は実環境の経験的証拠によって方向付けされて強化されています。
いくつかの異なるNMシーケンスからsiRNAがリストアップされているのはなぜですか?リスト内の各NMシーケンスの1番目を選択すべきですか?または、1つのNMシーケンスから1、2、および3番目を選択すべきですか?
リスト内に複数のNMシーケンスがある場合は、その遺伝子にtranscription variantsがあることを意味します。Rosettaアルゴリズムは、各cDNA transcriptに対して個別に実行されます。3つの固有のターゲット配列を確保するには、1つのRefSeqから3つのsiRNAを選択してください。
どのプレデザインsiRNAを注文すべきかを知る方法は?ナンバリングにはどのような意味がありますか?
Rosettaアルゴリズムに組み込まれている極めて重要なルールが、優れたターゲット特異性を導きます。プレデザインsiRNAのランク付けは1から10までで、1が最高ランクで10が最低ランクです。ポジティブコントロールsiRNAまたはバリデーション済みsiRNAは、「siRNA type」の列に記載があります。
実験と分析
安定したノックダウン細胞株が得られるようにsiRNAをゲノムに組み込めますか?
いいえ。安定したノックダウン細胞株が必要な場合は、shRNA製品ラインをご覧ください。
siRNAが遺伝子をサイレンシングする期間は?
siRNAから得られる遺伝子サイレンシングは、早ければトランスフェクション後24時間で評価できます。効果は、ほとんどの場合に5~7日間持続します。ただし、ノックダウンの期間とレベルは、細胞のタイプとsiRNAの濃度によって異なります。サイレンシングを持続させるためにトランスフェクションを繰り返すことができます。
siRNAの効果を強化できる方法は?
siRNA実験にenoxacinを追加することにより、siRNAのターゲット遺伝子サイレンシング能力が強化されることが示されています。詳細については以下の論文をご参照ください:
Shan G, Li Y, Zhang J, Li W, Szulwach KE, Duan R, Faghihi MA, Khalil AM, Lu L, Paroo Z, Chan AW, Shi Z, Liu Q, Wahlestedt C, He C & Jin P (2008).A small molecule enhances RNA interference and promotes microRNA processing.Nat Biotechnol, 26, 933-940.
その他に以下の文献も参考になります:
Duxbury MS, Ashley SW & Whang EE.(2005).RNA interference: A mammalian SID-1 homologue enhances siRNA uptake and gene silencing efficacy in human cells.Biochem Biophys Res Commun, 33, 459-63.
siRNAのプール品を提供していますか?
はい。duplex 5 nmol 4本分を1本のチューブ(20 nmolのプール)にしたものと、同量のduplex 5 nmol 4本分を1本のチューブ(20 nmolの追加プール)にしたもので構成される一般的な納品形態で、カスタムまたはプレデザインsiRNAをプールできます。しかし、私たちが開発した高度な液体取扱装置は、上記以外の幅広い納品方法を可能にします。
さらに、別の製品オプションにesiRNAがあります。これは、E. coli RNase IIIによる長鎖dsRNA(二本鎖RNA)の切断によって生じたsiRNAで構成されています。esiRNAは、すべてが同じmRNAをターゲットとするsiRNAのプールのため、高度な特異性をもっています。
個別に注文したduplexをプールするために推奨される手順はありますか?
はい。プールされる各duplexについて、その半量を取り出してから以下の手順に従ってください:
- 100 μLの分子生物学グレード水(W4502)で、各duplexを再懸濁します。乾燥siRNA材料に含まれた状態のため、バッファーは必要ありません。
- 各siRNAから50 μLを取り出して、新しいチューブに移します。
- 各チューブに残ったsiRNA溶液は、別の試験に使用できます。
siRNA保存溶液は、どの程度の濃度で作成すべきですか?
50~100 μMの濃度を推奨しています。
1X TEではなくRNaseフリー水中で乾燥siRNAを再懸濁できますか?
1X TE中での乾燥siRNAの再懸濁は推奨されません。
siRNAを再懸濁する前に、チューブを軽く遠心分離してください。siRNAはバッファーの存在下でドライダウンします(以下を参照)。そのため、siRNAは分子生物学グレード水(DNaseおよびRNaseフリー)(W4502)中で再懸濁する必要があります。
siRNAバッファー:
- 酢酸カリウム(100 mM)
- HEPES(30 mM)
- 酢酸マグネシウム(2 mM)
注記:siRNAは、取り扱い中に導入されるヌクレアーゼによる分解に影響を受けます。RNaseフリーの試薬、チューブ、およびフィルター付/バリアピペットチップを使用してください。siRNAを取り扱う際は必ず手袋を着用してください。
サンプル中のsiRNA濃度を計算する方法は?
この技術資料を参照してください。
nmolをμgに変換する方法は?
以下の式を使用して下さい:

ODはnmolやμgとどのような関係がありますか?
siRNAは以下のdsRNAに相当します:
- 1 A260ユニット= 60 μg dsRNA
したがって、
- 1 OD siRNA = 5 nmol = 60 μg
各種プレート/ウェルサイズに使用されるsiRNAの量は?2 OD(10 nmol)siRNAでトランスフェクションできる6ウェルプレートのウェル数は?
下表を参照してください(注記:最終siRNA濃度= 30 nM、1 nmol = 1000 pmol)。
新しい実験を開始する際に使用すべきsiRNA濃度は?
小規模のパイロット実験でsiRNAを試験し、5~100 nMの範囲の濃度を培養培地中で使用して各細胞タイプと新しい実験手順に最適な濃度をバリデーションすることを推奨しています。開始濃度は一般に30 nMが妥当であることを確認しています。望ましいノックダウンが得られる最小限の濃度を使用する必要があります。これにより、オフターゲット効果を低減できます。
細胞内で遺伝子が過剰発現している場合、siRNAはこれを効果的にサイレンシングできますか?
過剰発現した遺伝子は、siRNAを使用して正常にサイレンシングされることが示されています。過剰発現がどの程度抑えられるかを予測することは困難です。機能的なノックダウンを得るには、最終siRNA濃度と毒性/細胞自然免疫の問題とのバランスをとる必要性が生じることがあります。
サイレンシングしたい遺伝子が非常に安定しています。これはsiRNA実験にどのような影響を及ぼしますか?
一般的な参照遺伝子のGAPDHやサイクロフィリンBなどの安定した遺伝子でも、標準的なsiRNAの手法を使用して効果的にサイレンシングできます。細胞生存率解析の実施が常に良好にコントロールされている場合でも、最も安定的に発現した遺伝子によって示される可能性がある必須遺伝子の候補のサイレンシングが求められる場合には、これはさらに重要になります。
プレデザインsiRNAは、高発現で安定したmRNAのサイレンシングに効果的であることが示されています。遺伝子のタンパク質が非常に安定している可能性がある場合でも、siRNAを使用すればmRNAの安定性は大きな要素ではありません。RNAiは、mRNAを直接ターゲットにして切断してから、細胞のヌクレアーゼによって分解します。正しい経験的判断が行えるように、目的のmRNAに応じて必ずsiRNAの適正量を最適化してください。
不均一な(プールされた)母集団から個々のsiRNAを明確にするための最適な手法は?
個々のsiRNAを各自でプールするのではなく、プールされたsiRNAをご希望の場合は、プールの中に含まれるsiRNAを個別に注文して、実験で個別にテストする方法が最適です。プーリングと試験に適した濃度の個別のsiRNAを販売しています。
浮遊細胞にトランスフェクションする方法は?
メルクは、浮遊細胞に適したトランスフェクション試薬を提供していません。有効な試薬が数種類あり、他のメーカーから入手できます。
siRNAトランスフェクションのためのプロトコルや推奨試薬はありますか?
トランスフェクションのためのプロトコルは1つだけではありません。プロトコルは使用するトランスフェクション試薬によって異なります。以下の3種類の試薬を提供しています:
- MISSION® siRNAトランスフェクション試薬は、真核性遺伝子発現の一時的なノックダウンに用います。
- N-TER™ナノパーティクルsiRNAトランスフェクション試薬(販売中止)は、付着細胞用です(浮遊細胞株を除く)。ただし、細胞株がストレスを受けているか分化している可能性があり、さらに細胞の付着が始まっていれば、N-TER™(販売中止)が有効な場合があります。これは、U937細胞で観察されています。これらの細胞は、懸濁液中ではN-TER™(販売中止)でトランスフェクションできませんが、ストレスを受けて付着が始まっている場合はN-TER™(販売中止)でトランスフェクションできます。
- X-tremeGENE® 360トランスフェクション試薬は、動物や昆虫の細胞へ効果的にデリバリーします。
3種類のすべてのトランスフェクション試薬には、その製品注文ページにプロトコルを含む製品情報の記載があります。
細胞株に対してトランスフェクション条件を最適化する方法は?
細胞株に最適なトランスフェクション条件を特定するには、細胞密度とsiRNA濃度のマトリックスの構築が推奨されます。バリデーション済みで高効率のsiRNAを最適化のために用いるとよいでしょう。血清ありと血清なしのマトリックスが細胞株に適する場合には、これも試験する必要があります。細胞タイプに関わらず、N-TER™(販売中止)/siRNA複合体は迅速に細胞へ入るため、細胞を長時間インキュベーションしても意味がありません。ほとんどの付着細胞株は、不死化されているか初代かに関わらずN-TER™(販売中止)でトランスフェクションできます。
どの細胞をsiRNA実験に使用すべきですか?
多くの場合、細胞株は求められる研究の機能として選択されます。たとえば、肝機能に主眼を置く研究の場合は、肝細胞に由来するHepG2またはこれと同等の細胞株がよく使用されます。
siRNAで試験されているのはどの細胞株ですか?
ライフサイエンス研究にはHeLaおよびA549細胞株が一般に使用されているため、私たちのほとんどの試験はこれらの2種の細胞株で実施されています。
どのsiRNAコントロールが推奨されますか?
ポジティブコントロールとしては、ポジティブコントロールsiRNAを提供しています。ネガティブコントロールには、MISSION® siRNA Universalネガティブコントロールが推奨されます。
私たちは、カスタムのポジティブまたはネガティブコントロールの合成にも対応します。多くの研究者は、好んで使用する独自のスクランブル配列を持っています。また、luciferaseやeGFP siRNAコントロールを使用する研究者もいます。これらは、カスタムsiRNAと同じように注文できます。
luciferase(または他のマーカー遺伝子)のメリットは、該当するマーカー遺伝子とともに同時トランスフェクションする際に、これらのsiRNAをポジティブコントロールとしても使用できることです。
オフターゲット効果が生じています。どうすれば最小化できますか?
オフターゲット識別的遺伝子発現が原因で、RNAi実験から高品質のデータを得ることが困難なことがあります。この問題の解決法に関する明解な回答はありません。ノックダウン実験のためのesiRNAを提供しています。この製品は、オフターゲット効果を低減しながら効果的なノックダウンをもたらします。 esiRNAは、個別の設計と低濃度を使用できることにより、これを実現しています。
siRNAの典型的なオフターゲット効果とは?
siRNAは遺伝子の3’ UTRを認識してこれに結合するため、miRNA(microRNA)と同じようにふるまう可能性があり、意図しないオフターゲットサイレンシングを招くおそれがあります。平均すると、哺乳類mRNAの3分の1が1つまたは複数のmiRNAのターゲットです。そのため、siRNAがmiRNAの経路に入ると、重大なオフターゲットサイレンシング効果を引き起こすおそれがあります。
in vivoアプリケーションとN-TER™(販売中止)の使用
in vivo品質のsiRNAのデータはありますか?
はい。私たちはPerkinElmer(Bioo Scientific™)と協力して、MISSION® in-vivo品質siRNAを、Bioo Scientific™のMaxSuppressor™ In Vivo RNA-LANCEr II in vivo導入試薬でバリデーションしています。特定の導入試薬を見つけるには、PubMedを閲覧して類似した研究を確認してください。
in vivo実験専用のsiRNAはありますか?
はい。私たちは、MISSION® in-vivo品質siRNAを提供しています。この製品は、動物向けのiScale(中間規模)の量(mgおよびg)と、さらに規模の大きい研究に使用できます。
siRNA媒介ノックダウンがin vivoで持続する期間は?
MISSION® in-vivo品質siRNAのランディングページをご覧ください。また、特定の導入試薬を見つけるには、PubMedを閲覧して類似した研究を確認してください。
マウスのin vivo実験に必要なsiRNAの量は?
選択する導入試薬によって異なる場合があります。プロトコルについてはメーカーの技術告示をご覧ください。
siRNAはin vivoで毒性を示しますか?
MISSION® in-vivo品質siRNAのランディングページをご覧ください。また、特定の導入試薬を見つけるには、PubMedを閲覧して類似した研究を確認してください。
in vivo研究を開始する前に取り組むべき要素には何がありますか?
in vivo研究のための実験セットアップの概要をまとめる必要があります。これには、モデル生物の選択、導入経路、導入試薬の使用の有無、用量、および投薬の頻度などが含まれます。導入される濃度は、ターゲットの性質、発現パターン、および試験の規模に大きく左右されます。
siRNAはどのような組織に導入されていますか?
MISSION® in-vivo品質siRNAのランディングページをご覧ください。また、特定の導入試薬を見つけるには、PubMedを閲覧して類似した研究を確認してください。
in vivosiRNA実験にはどのコントロールを使用すべきですか?
MISSION® in-vivo品質siRNAのランディングページをご覧ください。また、特定の導入試薬を見つけるには、PubMedを閲覧して類似した研究を確認してください。
in vivoではsiRNAにどの導入試薬を使用すべきですか?
MISSION® in-vivo品質siRNAのランディングページをご覧ください。また、特定の導入試薬を見つけるには、PubMedを閲覧して類似した研究を確認してください。
N-TER™(販売中止)によりsiRNAのリバーストランスフェクションを行う簡単な方法はありますか?
はい。こちらをクリックしてプロトコルをダウンロードしてください。
プラスミドDNAをトランスフェクションするためにN-TER™(販売中止)を使用できますか?
いいえ。N-TER™(販売中止)はプラスミドDNAには機能しません。
siRNAをHUVEC細胞にトランスフェクションするためにN-TER™(販売中止)を使用できますか?
はい。こちらをクリックしてプロトコルをダウンロードしてください。
ネガティブコントロールとしてN-TER™(販売中止)を単独で使用できますか?
いいえ。N-TER™(販売中止)ペプチドを単独で使用すると細胞傷害活性を招くおそれがあります。ネガティブコントロールには、バッファーのみのコントロールと非ターゲットsiRNAの使用が推奨されます。
N-TER™(販売中止)と脂質ベーストランスフェクション試薬との比較は可能ですか?
ノックダウン評価の結果はN-TER™(販売中止)使用のほうが優っています。比較によれば、25の遺伝子ターゲットを検査した結果、N-TER™(販売中止)を使用した場合には、比較対象の脂質ベーストランスフェクション試薬より多い24がサイレンシングされました。生存率は同等であり、25ターゲット中7ターゲットについては比較対象の脂質ベーストランスフェクション試薬を使用したほうが高い生存率を示しました。生存率の全体的平均差異は、わずか7.1%でした。ノックダウンは、比較対象の脂質ベーストランスフェクション試薬の5 μLに対して、N-TER™(販売中止)を使用したほうが平均で22%上昇しました。比較対象の脂質ベーストランスフェクション試薬をより高い濃度で使用すると、生存率が影響を受け、25ターゲット中19ターゲットについてはN-TER™(販売中止)で処理した細胞よりも平均で13%の生存率低下を示しました。ただし、比較対象の脂質ベーストランスフェクション試薬の使用量を増やしても、25例中18例についてはN-TER™(販売中止)を使用したほうがサイレンシングの量が多いことに変わりはありませんでした。
N-TER™(販売中止)は、ペプチドベースのトランスフェクションシステムです。脂質ベースの試薬は通常、炎症性サイトカインの産生と遺伝子発現の全体的な変化(オフターゲット効果)をもたらすおそれのあるエンドソーム区画をターゲットとします。さらに、siRNAのターゲットがエンドソームの場合には、siRNAの分解を招くおそれがあります。N-TER™(販売中止)はエンドソーム区画を迂回するため、オフターゲット効果とsiRNAの分解が低減されます。
N-TER™(販売中止)は核または細胞質をsiRNAのターゲットにしますか?
N-TER™(販売中止)は、siRNAを細胞質へ放出するように修飾されています。siRNAの細胞質放出は、ノックダウン効率の増加と相関することが示されています。
N-TER™(販売中止)は共有結合反応によってsiRNAと結合しますか?
いいえ。N-TER™(販売中止)はsiRNAと非共有的に結合します。共有結合はsiRNAの取込みを増加させるおそれがあり、共有結合したsiRNAの放出は高効率で迅速なノックダウンを妨げるおそれがあります。非共有的に結合したsiRNAは、トランスフェクションした細胞の細胞質へ極めて迅速に放出され、結果として迅速なmRNAノックダウンが得られます。
トランスフェクションの規模を拡大する方法は?
大容量の場合は、N-TER™(販売中止)/siRNA複合体形成の効率が下がります。3倍容量への拡大を推奨しています。複合体形成が完了してから、これらの3倍容量を組み合わせることができます。
N-TER™(販売中止)に関する参考文献はありますか?
はい。こちらで引用文を参照してください。
バリデーションと保証
プレデザインsiRNAはどのようにバリデーションされていますか?
バリデーションには以下の2つのパートがあります:
- Rosettaアルゴリズムを用いて、すべてのプレデザインsiRNAをin silicoでバリデーションします。
- プレデザインsiRNAのサブセットを、概要に従って機能的にバリデーションします。
- トランスフェクション試薬:さまざまなトランスフェクション試薬を用いて、siRNAコンストラクトを機能的にバリデーションします。
- siRNA濃度:さまざまな濃度を使用します。50 nMが最も一般的で、60%を超えるバリデーション作業に使用されます。50 nMが主に使用される理由は、Rosettaアルゴリズムをバリデーションするために使用する濃度だからです。続いて、はるかに低い濃度で性能を確認します。
- 細胞株:ほとんどすべてのバリデーション試験は、HeLa細胞で実施されます。
- 納品形態:96ウェルプレート
- 反復:バリデーション対象の各siRNAについて、少なくとも3回の生物学的反復と3回の技術的反復を実施します。さらに、ほぼすべてのバリデーション実験では生存率試験が実施されます。
- mRNAを採取するまでの時間:ほとんどの測定値は、トランスフェクション後24時間の時点で取得されます。
- ノックダウンの検出:分岐DNA法またはqPCR
siRNAが遺伝子をノックダウンすることを保証しますか?
1ターゲット遺伝子につき3つのプレデザインsiRNA中2つが75%以上のmRNAレベルでのノックダウン効率を達成することを保証します。カスタム設計siRNAは保証の対象外です。全保証内容をご確認ください。
保証を受けるためにはどのようにして3つのsiRNAを選択する必要がありますか?
新しい実験を開始する際は、上位3つのプレデザインsiRNAを選択するよう推奨しています。
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